蛋白质裂解物提取:一种裂解类器官以收集细胞蛋白质的技术

细胞裂解物或含有裂解细胞内容物的液体可应用于蛋白质提取和分析等下游过程。研究这些分数可以揭示有关细胞特征和功能的信息。

要制备类器官蛋白裂解物，首先培养在所需基底膜基质中生长的类器官。从培养皿中取出用过的培养基。在基质上加入含有蛋白酶的温培养基。反复移液以将基质从培养皿中移出。

孵育混合物。培养基中的蛋白水解酶降解基质并将类器官释放到溶液中。离心样品以从含酶的上清液中分离类器官。

类器官沉淀重悬于合适的蛋白质裂解缓冲液中。孵育样品。缓冲液中的去垢剂会破坏类器官的细胞膜，将细胞内内容物释放到溶液中。同时，缓冲液中的蛋白质抑制剂使任何释放的蛋白酶和磷酸酶失活，防止其底物蛋白降解。

此外，对混合物进行超声处理以完全破坏细胞。核膜破裂并将核蛋白释放到溶液中。声波还剪切释放的核酸，防止它们污染蛋白质裂解物。

要收集类器官，通过将 1 毫升预热的含分散酶培养基直接移液到基质凝胶环上，反复喷射基质凝胶，直到整个环脱落。将脱落的基质凝胶类器官混合物转移到 1.5 毫升微量离心管中。完全消化后，如文本方案中所述，将磷酸盐缓冲盐水添加到类器官沉淀中，并通过轻弹来重悬。

在室温下以 800 x g 离心 5 分钟沉淀类器官，并使用微量移液器除去上清液。将类器官沉淀重悬于每 10 微升填充细胞体积 100 微升蛋白质裂解缓冲液中。轻拂以重新悬浮。现在，通过将管子浸入湿冰中并将声波消去器的尖端轻轻地施加到微量离心管的外部来对类器官进行超声处理。在20 kHz下超声处理40秒，然后使用既定协议进行蛋白质印迹。