整体免疫荧光成像:一种评估完整类器官的固定和染色技术

前列腺类器官主要构成基底上皮细胞的外层和围绕中央管腔排列的管腔上皮细胞的内层。

全贴片成像允许研究完整的 3D 类器官，同时保持其形态和异质性。要开始染色，请用合适的固定剂处理类器官，将其细胞成分锁定到位，从而保留它们。清洗样品以去除多余的固定剂。

与封闭溶液和 DNA 染色染料的混合物一起孵育。封闭溶液中的蛋白质被动地与细胞的非特异性位点结合，并减少任何背景染色。同时，DNA 染色染料对细胞核进行染色。

添加两组靶向两个组成细胞群表达的特异性抗原的一抗。与与一抗结合的两种不同的荧光染料偶联二抗孵育。洗涤样品以去除任何未结合的抗体。

将染色的类器官依次浸入浓度增加的含表面活性剂的糖溶液中，以提高组织透明度而不影响类器官结构。这种处理增强了样品的成像深度。

类器官安装在带有垫片的显微镜载玻片上，以在成像时保留其 3D 形态。使用共聚焦显微镜观察排列在中心腔周围的基底和管腔细胞群的荧光发射。

要对前列腺类器官进行全贴片免疫荧光染色，首先，在PBS中加入500微升4%多聚甲醛。将类器官在室温下孵育2小时，轻轻摇晃。按照文本方案中的描述洗涤沉淀后，在封闭溶液中加入每毫升 1 微克 DAPI 染色剂，并在室温下孵育 2 小时。从这一步开始，在孵育过程中保护样品免受光照。像以前一样离心类器官后，加入一抗和封闭溶液，并在4摄氏度下轻轻摇晃孵育过夜。

再次沉淀类器官，并用 1 毫升 PBS 轻轻摇晃洗涤沉淀 15 分钟。重复此洗涤过程两次。然后，加入二抗和封闭溶液，在4摄氏度下轻轻摇晃孵育过夜。孵育后，沉淀类器官并再洗涤沉淀两次。将 1 毫升 30% 蔗糖和 1% Triton X-100 的 PBS 加入沉淀类器官中。然后，在室温下轻轻摇晃孵育2小时。

再次沉淀类器官后，在PBS中加入1毫升45%蔗糖和1%Triton X-100，并在室温下轻轻摇晃2小时。然后，重复该过程，除了在PBS中加入1毫升60%蔗糖和1%Triton X-100。在室温下以 800 x g 离心 3 分钟沉淀类器官，并除去 95% 的上清液。在紫外线下观察沉淀，以确认在去除上清液时没有丢失。随着蔗糖浓度升高，沉淀变得更松散。将 10 至 20 微升剩余悬浮液转移到腔室盖玻片上，然后进行共聚焦显微镜检查。