0 次观看 • 3:45 分钟 • April 30th, 2023
自噬是一种细胞内过程，可在称为溶酶体的特异性消化区室中降解不需要的细胞质成分和细胞器。为评估自噬活性，首先准备表达与绿色荧光蛋白偶联的自噬标志蛋白LC3的贴壁培养前列腺癌细胞。
前列腺癌细胞本身缺乏合成精氨酸所必需的酶——精氨琥珀酸合成酶，因此这些细胞的存活和增殖依赖于培养基中外源性精氨酸的补充。
接下来，用精氨酸脱亚胺酶（arginine deiminase，ADI）处理细胞。ADI 会水解培养基中的游离精氨酸，导致精氨酸耗竭。因此，细胞将经历代谢应激，从而在细胞内启动自噬反应。同时，用一种可标记细胞内溶酶体的红色荧光染料处理细胞。
在自噬过程中，称为吞噬体的杯状膜结构会在受损的细胞质组分周围组装。随后，它们不断扩展并包裹其内容物，同时与自噬标志蛋白 LC3 结合，形成双层膜囊泡，即自噬体。LC3 蛋白还可为自噬体提供荧光标记。这些囊泡随后与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体内的溶酶体蛋白酶会降解所包裹的细胞组分。
实时观察自噬体和溶酶体发出的明亮荧光，以确定其在细胞内的分布情况。
首先，按照文本方案所述，将表达绿色荧光蛋白偶联的轻链3的人前列腺癌细胞培养于35毫米多聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿中。
细胞接种密度应足够高以促进快速增殖，但不宜过高，以免细胞在成像时过度生长并发生聚团。用磷酸盐缓冲液（PBS）中的精氨酸脱亚胺酶（arginine deaminase, ADI）处理选定的细胞样本，以耗尽细胞内的游离精氨酸，从而在癌细胞中诱导代谢应激。
成像前约一小时，将1.5 µL LysoTracker Red 溶于20 mL含10% FBS和1%抗生素的RPMI培养基中。针对已处理的选定样品，制备含有ADI的溶液。
将所有培养基预热至 37 摄氏度后，向每个培养皿中加入相应的培养基。在 37 摄氏度条件下，用含有 LysoTracker Red 的 RPMI 培养基孵育细胞 15 至 45 分钟。
成像前约30分钟，打开气象站环境培养箱，使其平衡至37摄氏度和5%二氧化碳。用PBS洗涤细胞，并将培养基更换为仅含10% FBS和1%抗生素的标准RPMI培养基。
按指示向样品中加入 ADI。将 35 毫米玻璃底培养皿安装至定制适配器中。在 60 倍放大、数值孔径 1.42 的物镜上使用浸油，并将安装好的培养皿置于显微镜载物台上。