蛋白质提取与蛋白酶解：一种从前列腺肿瘤组织样本中获取蛋白质并将其酶解为肽段的方法

取前列腺肿瘤组织样本开始实验。将样本重悬于预冷的裂解缓冲液中以启动细胞裂解。使用匀浆器进一步破坏组织结构，释放细胞内组分。在冰上进行超声处理，以确保细胞完全裂解并剪切DNA，防止其在肽段处理过程中产生干扰。加热裂解液以破坏蛋白质的 三级结构并使其解折叠。

缓冲液中的还原剂会断裂半胱氨酸残基之间的二硫键。随后，缓冲液中的烷基化试剂对还原后的半胱氨酸游离巯基进行烷基化，以防止二硫键重新形成。缓冲液中额外的变性剂有助于实现可控变性并进一步促进蛋白质的展开。

离心以沉淀组织碎片及任何污染物。收集含有蛋白质混合物的上清液至新的离心管中。加入赖氨酰内肽酶，特异性切割赖氨酸残基C端的肽键，生成较大的肽段。随后，使用胰蛋白酶处理，切割赖氨酸和精氨酸残基C端的肽键，产生较小的肽段。将混合物转移至离心过滤装置中。

离心，使消化后的肽段透过滤膜孔隙，收集滤过液。任何较大的片段则保留在滤膜上，形成截留物。

为获取肿瘤组织，先称量肿瘤重量，然后在培养试管中按每100毫克组织加入2毫升预冷的裂解缓冲液。随后，使用手持式或台式匀浆器对裂解液进行匀浆处理。

为还原并烷基化样品，将离心管在95摄氏度加热5分钟，然后在冰上冷却样品15分钟。保持样品处于冰上时，对裂解液进行三次超声处理。随后，将样品在95摄氏度加热5分钟。

将此超声处理管放入摆桶式转子中，在15摄氏度下以3,500 × g 离心15分钟。然后收集上清液，弃去沉淀。为消化裂解液，使用100毫摩尔的Tris将样品稀释12倍，以减少胍盐含量。对于5毫克蛋白质，加入10微克赖氨酰内肽酶（Lysyl Endopeptidase，Lys-C），并在室温下孵育5至6小时。

将TPCK处理的胰蛋白酶以1毫克/毫升的浓度溶于含20毫摩尔/升氯化钙的1毫摩尔/升盐酸中，胰蛋白酶与蛋白质的比例为1:100。将样品在37°C下孵育3小时。然后，向管中加入额外一份胰蛋白酶，并将样品在37°C下过夜孵育。

将样品加入一个15毫升、截留分子量为10 kDa的滤膜管中。在3,500 × g 离心力、15摄氏度条件下，使用摆桶转子或固定角转子离心，直至截留液体积小于250微升。随后，收集穿滤液，并弃去截留液。