0 次观看 • 4:50 分钟 • April 30th, 2023
特定氨基酸残基（如酪氨酸）的磷酸化可生成磷酸化肽段，这些肽段在调控多种细胞信号通路中发挥关键作用。研究这些肽段有助于发现癌症治疗中潜在的生物标志物。
为了分离磷酸化肽段，首先使用从癌组织中提取的纯化肽段消化产物的冻干粉末。将粉末重悬于适当的缓冲液中，以制备均匀的肽段悬浮液。保持中性pH值以确保肽段的稳定性。
在所需的缓冲液中制备含有与特异性抗磷酸肽抗体偶联的水凝胶微珠的悬液。将微珠悬液加入肽段悬浮液中。固定在微珠上的抗体可识别并结合磷酸化肽段中特定的磷酸化氨基酸残基，形成复合物。
离心混合物，使磷酸化肽-磁珠复合物沉淀至沉淀中。弃去含有未结合肽段或非特异性磷酸化肽段的上清液。向复合物中加入适量的低pH洗脱缓冲液并孵育。低pH会减弱磷酸化肽残基与抗体-磁珠复合物之间的相互作用，从而将肽段释放到溶液中。
将混合物转移至预先组装好的滤芯。离心以洗脱释放的磷酸化肽段至收集管中。在较高温度下真空浓缩样品，去除缓冲液，获得浓缩的纯磷酸化肽段干沉淀。
将冻干粉末用0.5毫升预冷的免疫沉淀（IP）结合缓冲液重悬于各组分中。将第二组分中的0.5毫升重悬液转移至第一组分的离心管中，并保留移液器吸头。在将内容物转移至冻存管之前，使用另外0.5毫升IP缓冲液冲洗每个冻干管。随后，用2毫升IP缓冲液重复冲洗一次。
使用P200移液器配合切去尖端的吸头，将0.5毫克/毫升的抗体磁珠悬液原液转移至微量离心管后，向管中加入450微升预冷的IP结合缓冲液，以洗涤50微升4G10抗体磁珠悬液和25微升27B10.4抗体磁珠悬液。在4摄氏度下以100 × g 离心1分钟。吸除上清液后，加入与原始磁珠悬液体积相等的IP结合缓冲液，重悬磁珠。将预洗过的pY磁珠加入至螺口冷冻管中的重悬样品溶液中，随后在4摄氏度下于翻转摇床中孵育过夜。离心沉淀磁珠后，保留上清液，用于后续富集pST肽段。
接下来，使用 300 µL IP 结合缓冲液重悬磁珠，并将其转移至一个 2 mL 微量离心管中。在 4 °C 条件下，以 100 × g 离心 1 分钟，使样品沉淀。随后，用 500 µL IP 结合缓冲液洗涤磁珠三次。再用 450 µL 的 25 mM 碳酸氢铵（pH 7.5）洗涤磁珠四次。将加样枪头轻轻插入磁珠表面以下，彻底吸除上清液。向磁珠中加入相当于其体积四倍的 0.1% 三氟乙酸（TFA）。
然后充分混匀，并在37°C、1,000 rpm条件下于恒温混匀仪中孵育15分钟。将重悬液转移至0.2微米的离心过滤管中，在850 ×g条件下离心1分钟。将滤出液转移至低蛋白吸附的微量离心管后，于40°C下真空浓缩干燥，加热时间设为300分钟，过夜进行。