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磷酸肽是含有磷酸化丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的短氨基酸串。要从肽混合物中分离磷酸肽，首先将二氧化钛珠放入管中。使用含有淬灭剂的合适酸化结合缓冲液平衡以调节珠子。将所需浓度的肽混合物加入珠浆中。
连续摇动孵育混合物，以防止珠子沉淀。酸性条件促进磷酸肽的磷酸基团与钛珠形成配位键。缓冲液中的淬灭剂减少了非磷酸化肽与珠子的任何非特异性结合，使它们留在悬浮液中。
离心以沉淀磷酸肽结合的珠子，而非磷酸化肽保留在上清液中。弃去上清液。将磷酸肽结合的珠子转移到预组装的离心滤光谱柱中。离心以去除结合缓冲液并捕获磷酸肽偶联的珠子。
将过滤器转移到干净的管中并加入含氨溶液。氨使悬浮液变为碱性，导致磷酸肽与珠子脱离。离心组件以洗脱并收集未结合的磷酸肽。二氧化钛珠留在滤芯中。干燥磷酸肽以去除任何氨痕迹。
用 500 微升 100% 乙腈对二氧化钛进行预处理两次。然后，用 500 微升 0.2 M 磷酸钠缓冲液（pH 7）调节二氧化钛两次。最后，使用 300 微升平衡缓冲液洗涤珠子 3 次。将 400 微升 50% 乙腈、0.1% TFA 加入低蛋白结合管中。然后，加入 84 微升乳酸。
将重悬的磷酸肽转移到低蛋白结合管中，并使用端对端旋转器在室温下孵育 1 小时。将珠子沉淀后，使用 300 微升平衡缓冲液洗涤两次并旋转。用 300 微升冲洗缓冲液冲洗珠子两次。然后，将它们转移到 0.2 微米的自旋滤光片中。
旋转后，将过滤装置转移到干净的 1.5 毫升低蛋白结合管中，并用 200 微升 0.9% 铵水洗脱内容物两次。检查pH值后，将洗脱液真空浓缩至干燥过夜，以蒸发氨。
