基因组 DNA 的亚硫酸氢盐转化:一种研究胃肠道癌症组织基因组 DNA 样本中 DNA 甲基化的方法

DNA甲基化涉及甲基加成到DNA的胞嘧啶残基上形成甲基胞嘧啶，引起DNA改变和基因表达调控。

要研究 DNA 甲基化，首先从癌细胞中提取粗 DNA 提取物。加入稀释缓冲液并在室温下孵育。缓冲液稀释混合物并将双链 DNA 变性为单链 DNA，有利于碱基的可及性以进行后续反应。

加入转化试剂并在黑暗中孵育。试剂中的亚硫酸氢钠触发未甲基化胞嘧啶残基的磺化和随后的脱氨，导致尿嘧啶-磺酸盐的形成。然而，甲基化胞嘧啶残基保持不变。

接下来，用结合缓冲液补充 DNA 并将其转移到预组装的离心过滤器柱中。缓冲液有助于 DNA 与过滤器结合。

心以从色谱柱中捕获的 DNA 中去除缓冲液和亚硫酸氢盐试剂混合物。丢弃流通。向 DNA 中添加碱性脱磺缓冲液。缓冲液有助于从尿嘧啶-磺酸盐中去除亚硫酸盐基团，形成尿嘧啶。

心以除去用过的缓冲液。现在，在色谱柱中加入洗脱缓冲液以洗脱转化的 DNA。进行PCR扩增DNA。所有转化的尿嘧啶残基都扩增为胸腺嘧啶，而甲基化胞嘧啶残基扩增为胞嘧啶。

扩增的 DNA 的胞嘧啶残基进行测序，以生成样品的甲基化谱。

根据制造商的说明，使用亚硫酸氢盐转化试剂盒对 45 微升消化的组织进行亚硫酸氢盐处理。向样品中加入5微升稀释缓冲液，并在37摄氏度下孵育15分钟。同时，将750微升蒸馏水和210微升稀释缓冲液加入一管CT转化试剂中，制备亚硫酸氢盐转化试剂。通过涡旋混合试管 10 分钟。然后，向每个样品中加入100微升制备的CT转化试剂，并通过倒置混合。

样品在 50 摄氏度的黑暗中孵育 12 至 16 小时。孵育后，将样品放在冰上10分钟。加入 400 微升结合缓冲液，并通过上下移液混合每个样品。将每个样品加载到离心柱中，并将色谱柱放入 2 毫升收集管中。将样品全速离心 1 分钟，然后丢弃流过的样品。向每根色谱柱中加入 200 微升洗涤缓冲液，全速旋转 1 分钟，然后丢弃流通液。

每根色谱柱中加入 200 微升脱磺缓冲液，并让色谱柱在室温下静置 15 分钟。孵育后，全速旋转色谱柱 1 分钟，然后丢弃流过的液流。用 200 微升洗涤缓冲液洗涤色谱柱两次，每次洗涤后全速离心 1 分钟。

每根色谱柱中加入 46 微升蒸馏水，并将其放入新的无菌 1.5 毫升一次性聚丙烯管中。旋转试管 2 分钟以洗脱 DNA 并丢弃色谱柱。DNA 现在已准备好进行分析。使用亚硫酸氢盐修饰的DNA作为定量甲基化特异性PCR的模板，以评估每个基因分析中启动子区域的甲基化。按照文本手稿中的描述组合试剂，并使用 96 孔实时荧光定量 PCR 仪器运行热循环方案。