中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的荧光显微镜观察:一种用于观察癌细胞与NETs之间黏附相互作用的技术

0 次观看3:15 分钟 • April 30th, 2023

在癌症等病理条件下,活化的中性粒细胞会释放中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)——一种由细胞外DNA与相关酶及抗菌蛋白构成的网状结构——从而捕获循环中的癌细胞。

为了在体外可视化中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)与肿瘤细胞之间的黏附相互作用,首先在经聚合物包被的培养皿中培养低密度中性粒细胞(一种中性粒细胞亚型),以促进细胞贴壁。孵育数小时以刺激中性粒细胞形成网状的NETs。

将红色荧光素标记的癌细胞悬液加入中性粒细胞培养物中。使癌细胞与中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)短暂孵育,以促进癌细胞与NETs之间的相互作用。NET-DNA作为趋化因子,可吸引癌细胞并促进其黏附于NETs。

移除用过的培养基。用适量的新鲜培养基轻轻洗涤培养孔,以去除未贴壁的肿瘤细胞。

现在,加入一种膜不通透的绿色荧光细胞核染料,以选择性地染色细胞外的中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)。在荧光显微镜下观察培养物。中性粒细胞胞外诱捕网呈现为绿色的丝状结构,形成网状,红色的肿瘤细胞附着其上。

将分离得到的低密度中性粒细胞重悬于RPMI 1640培养基中,细胞浓度为每毫升5 × 10⁶个细胞,培养基中添加适当浓度的胎牛血清(FBS),每孔接种1毫升中性粒细胞至6孔聚-L-赖氨酸包被的培养板中。在37°C、5%二氧化碳条件下孵育2小时后,根据制造商说明书,用适当的荧光性膜不透性核及染色体染料对每孔细胞进行染色,并立即通过荧光显微镜观察中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形态。

为评估肿瘤细胞与中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的黏附情况,用一种对比性荧光染料标记胃肿瘤细胞,并将其重悬于补充有0.1%牛血清白蛋白的RPMI 1640培养基中,细胞浓度为1 × 10⁶ 个/毫升,随后向每孔低密度中性粒细胞培养物中加入1毫升肿瘤细胞悬液。在37°C孵育5分钟后,吸除每孔的上清液,并用2毫升预热的含BSA的RPMI 1640培养基轻轻洗涤细胞两次,每次洗涤使用2毫升。

5 分钟的孵育时间足以检测 NET 特异性结合。将预热的培养基缓慢沿每孔侧壁加入,轻轻摇晃培养板,然后用吸液器吸除上清液。

随后可通过荧光显微镜观察NETs及其附着的肿瘤细胞。

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最后更新:22 八月 2026