延时荧光显微镜观察中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）：一种用于分析癌细胞与NETs黏附后相互作用的技术

在癌症等病理条件下，活化的中性粒细胞会释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）——一种由细胞外DNA纤维与组蛋白及蛋白水解酶结合形成的网状结构。这些结构可捕获癌细胞，并在癌症转移过程中发挥关键作用。

为了在体外研究被中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）捕获的癌细胞在黏附后的生物学行为，首先将低密度中性粒细胞（一种中性粒细胞亚群）接种于经聚合物包被的培养皿中进行培养，以促进细胞贴壁。随后孵育以激活中性粒细胞，使其释放网状结构的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。

接下来，加入一种膜不通透的绿色荧光核染料，以特异性染色 NETs 中的 DNA 纤维。移除用过的培养基。将癌细胞悬液加入中性粒细胞培养物中。

短暂孵育培养物以促进癌细胞与中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的相互作用。NET 中的 DNA 组分作为一种趋化因子，可刺激癌细胞的迁移，并有助于癌细胞黏附于 NET。

移除用过的培养基。用适量的新鲜培养基轻轻冲洗培养物，以去除培养皿中未结合的癌细胞。补充含有血清的新鲜培养基。

使用延时视频显微镜对培养物进行长时间成像，以分析中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）与癌细胞之间的相互作用事件。随着时间推移，NETs 提供了一个适宜的微环境，促进癌细胞的增殖。使用合适的软件观察癌细胞在绿色荧光标记的 NETs 上的增殖情况。

在35毫米培养皿中培养并染色腹膜低密度中性粒细胞，培养皿预先用聚-L-赖氨酸包被，随后用2毫升含0.1% BSA的RPMI 1640培养基短暂洗涤。

将培养基替换为含有 2 毫升添加 BSA 的 RPMI 培养基的 1 × 10⁶ 个未标记的胃肿瘤细胞，室温孵育 5 分钟。孵育结束后，用 2 毫升新鲜的添加 BSA 的 RPMI 培养基在室温下清洗细胞 5 分钟，随后轻轻晃动以去除未贴壁的肿瘤细胞。

然后，用添加了胎牛血清和抗生素的DMEM替换上清液，并将培养皿置于全视野细胞观察系统中，对中性粒细胞胞外诱捕网捕获肿瘤细胞的过程进行活细胞成像分析。