外泌体切片的金免疫染色:一种在外泌体腔中可视化诊断标志物的技术

0 次观看3:36 分钟 • April 30th, 2023

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外泌体是包裹着各种生物分子的小细胞外囊泡,这些生物分子可作为癌症生物标志物。

要可视化外泌体生物标志物,请从支撑在合适的电子显微镜金属网格上的超薄树脂包埋外泌体切片开始。在甘氨酸滴中孵育网格。甘氨酸结合并中和切片中的活性醛基团,以克服它们对测定的干扰。

用水冲洗样品以去除残留的试剂。随后,将样品在封闭缓冲液中孵育。缓冲液携带血清蛋白,可阻断样品中的非特异性抗体结合位点。

接下来,将样品在所需的一抗溶液中孵育。这些抗体识别并结合位于外泌体管腔中的靶标生物标志物。用合适的缓冲液洗掉任何未结合的抗体。

现在,将携带样品的网格转移到含有金偶联二抗的液滴中,这些二抗附着在一抗上。金纳米颗粒作为电子密集标记,可可视化目标分子的精细定位。用合适的缓冲液洗掉任何未结合的二抗。

最后,在黑暗条件下,将网格依次在乙酸铀酰和柠檬酸铅溶液中孵育。这些重金属试剂对样品中脂质、蛋白质和糖原等有机分子进行染色并增强对比度,将它们与背景区分开来。

在透射电子显微镜下观察染色切片。金标记的生物标志物在重金属染色的外泌体结构的管腔内表现为深色颗粒。

首先,将含有 60 纳米厚未染色切片的网格在 50 微升 0.02 M 甘氨酸滴中孵育 10 分钟,以淬灭游离醛基团。然后,用 100 微升蒸馏水冲洗切片 3 次,每次 10 分钟。最后一次冲洗后,将切片在室温下在含有1%BSA的PBS中孵育1小时。然后,将网格在50至100微升抗KRS抗体滴中孵育1小时。

接下来,在一滴含有0.1%BSA的PBS中洗涤网格五次,每次10分钟。然后,将网格转移到一滴适当的二抗中,并在室温下孵育切片1小时。现在,用单独的一滴含有0.1%BSA的PBS洗涤网格五次,每次10分钟。用 2% 醋酸铀酰在黑暗中对切片进行双重染色 20 分钟,然后用雷诺柠檬酸铅染色 10 分钟。将染色切片放入透射电子显微镜中,使用 80 kV 观察样品,并使用显微镜软件对其进行成像。

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最后更新:1 八月 2026