纯化外泌体的负染色法：利用透射电子显微镜观察外泌体形态的实验步骤 关键词：外泌体，负染色，透射电子显微镜，形态学，纯化，纳米囊泡

为了对外泌体（一种纳米级球形囊泡）进行负染色，首先取一个合适的透射电镜载网。使用辉光放电器对载网进行预处理，该过程可使载网表面变为亲水性，从而更有利于样品的附着。

同时，取一管含有纯化外泌体的悬液。向管中加入多聚甲醛（一种样品固定剂）并进行孵育。多聚甲醛可穿透外泌体，交联其中的蛋白质和核酸。此步骤对于保持外泌体的形态至关重要。

现在，将外泌体悬液加样至预先准备好的载网上，孵育以使吸附发生。接着，在载网上滴加数滴醋酸铀，即重金属染色剂。铀离子会结合膜蛋白和脂质，在外泌体边界周围形成沉积物。

最后，用清水洗涤载网以去除多余的染色剂。让载网干燥后，使用透射电子显微镜（TEM）进行成像。

当电子束照射到外泌体时，围绕样本的染色剂会散射更多的电子。由于外泌体电子密度较低，允许电子束穿过。这些散射程度不同的电子被成像系统捕获，从而形成高对比度的图像。

经负染色的外泌体呈较浅的形态，周围有深色边界。

为了进行负染色，分离后使用1毫升2%多聚甲醛将纯化的外泌体固定5分钟。将涂有薄层Formvar/碳膜的200目铜制透射电镜载网进行辉光放电处理1分钟。然后，将5至7微升外泌体悬浮液滴加到载网上，孵育1分钟。如果外泌体浓度过高，需将其稀释至适当浓度。

立即在电镜载网表面加入约20滴过滤后的1%醋酸铀溶液对外泌体进行染色。通过将载网边缘接触滤纸去除载网上多余的醋酸铀溶液。随后，用一滴水快速冲洗载网。

使用镊子将载网放置于台面上，并用培养皿部分覆盖载网。在室温下干燥10分钟，随后对载网进行成像，或将其存放在透射电镜载网盒中以备后续观察。