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速冻是一种将组织样本迅速冷冻至超低温的技术,有助于保持组织内DNA、RNA和蛋白质的天然结构。
为了快速冷冻肢体肌肉,首先从一只小鼠的后肢获取新鲜提取的肌肉组织。
接下来,将液氮放入泡沫箱中,并将装有异戊烷(一种高导热性液体)的烧杯浸入液氮中。
将异戊烷冷冻至溶液变得黏稠。同时,在软木塞片上滴加一滴液态冷冻介质。
握住后肢肌肉组织的肌腱,将组织块垂直嵌入液态冷冻介质中。这种方向有助于后续测定肌肉的横截面积。
将带有肌肉组织的软木片短暂浸入预冷的异戊烷浴中。这有助于肌肉组织快速且均匀地冷冻。
冷冻介质在低温下凝固,在肌肉组织周围形成一层胶状层,从而将其固定在原位。将肌肉组织块置于冷冻切片机中,以获得薄切片。
将切片置于玻璃载玻片上,并在较低温度下保存,以备进一步进行组织学分析。
当所有肌肉组织收集完毕后,将装有异戊烷的塑料50毫升烧杯下半部分浸入液氮中。当异戊烷变得略微粘稠,且烧杯内壁出现可见的白色固态层时,向样品夹上滴加几滴包埋介质。
然后,用镊子夹住肌腱提起肌肉,小心地将新鲜肌肉的一端垂直放置在包埋介质上方,使其相对于软木塞保持垂直。接着,在保持肌肉垂直的同时,将持样品头及其附着的肌肉浸入异戊烷浴中 7 到 15 秒,直至组织完全冻结。充分冻结的标本将呈现乳白色。随后,将肌肉放入标本管中,立即在负 80 摄氏度条件下储存。
为了保存样本中的RNA以及酶的结构和活性,肌肉组织在提取后应尽快冷冻。
为了切取冷冻肌肉组织,首先将冷冻切片机内腔的工作温度设置为负23摄氏度。让存放于负80摄氏度的样本在该工作温度下平衡数小时。随后,在肌肉的中腹部区域垂直于包埋轴向切取多个厚度为8 µm的切片,并在切片过程中将其收集到室温的玻璃载片上。所有切片收集完毕前,样本应始终保持在冷冻切片机腔体内。切片完成后,将样本储存于负80摄氏度,待后续分析使用。