固有层单个核细胞分离：一种基于二氧化硅密度梯度离心法从小鼠结肠获取单个核细胞的技术

位于肠上皮下方的肠固有层由疏松结缔组织构成，并含有致密的胶原纤维网络，其中包含多种细胞，如成纤维细胞和单核细胞（包括淋巴细胞和单核细胞）。这些细胞在维持稳态中发挥关键作用。

为了分离单个核细胞，首先取小鼠结肠组织片段。用含有胶原酶的消化缓冲液处理这些组织片段。胶原酶可降解组织中的胶原纤维，使细胞释放到悬浮液中。 

收集上清液，并通过细胞筛过滤，以去除未消化的组织和碎片，获得单细胞悬液。向滤液中加入预冷的缓冲液，以灭活胶原酶。 

离心以分离细胞。弃去含有酶的上清液，并将细胞沉淀重悬于低密度二氧化硅基分离介质中。接着，将该悬液铺在高密度二氧化硅基分离介质上方，形成密度梯度。

离心混合物。单个核细胞会沉淀，并在密度梯度层之间形成白色界面层。小心地将白色界面层转移至含有合适缓冲液的新离心管中。

离心以获得含有纯化单个核细胞的沉淀。用缓冲液重悬沉淀，用于后续分析。

首先，向含有洗涤后结肠片段的离心管中加入 20 毫升胶原酶消化缓冲液。密封离心管，并将其置于 37 摄氏度的轨道摇床中，以 2 ×g 的转速振荡 60 分钟。确保组织片段在振荡过程中持续运动。

将5毫升66%的基于二氧化硅的密度分离介质分别倒入三个独立的15毫升聚丙烯管中。接下来，使用25毫升血清移液管，仅从胶原酶消化1中收集上清液。将上清液通过置于洁净的50毫升聚丙烯锥形管上的40微米孔径滤膜细胞筛进行过滤。用预冷的结肠缓冲液将管完全充满，以终止胶原酶消化缓冲液的作用。然后，离心细胞，吸除上清液，并将沉淀物置于冰上保存。

继续按照文本方案中所述进行第二次胶原酶消化。完成第二次胶原酶消化后，使用18G钝头针将组织碎片在试管与10毫升注射器之间反复强力冲洗。至少重复冲洗七至八次，直至肉眼不可见明显的组织碎片或残渣为止。

接下来，将组织解离悬液通过置于洁净的50毫升聚丙烯管中的40微米孔径滤膜细胞筛进行过滤。加入预冷的结肠缓冲液至管口，以终止消化反应，随后在4摄氏度下以800 × g 离心5分钟。

通过真空抽吸弃去上清液，并将来自第一次胶原酶消化的重悬沉淀物转移至对应的离心管中。随后，每结肠组织的沉淀物用 24 毫升 44% 基于二氧化硅的密度分离介质重悬。使用 10 毫升血清移液管，将上述介质缓慢分层加入三根含有 66% 基于二氧化硅的密度分离介质的离心管中，每管加 8 毫升。

使用天平或称重仪在离心机吊桶内仔细平衡离心管。在20摄氏度条件下以859 × g 离心20分钟，期间不刹车。待转子完全停止后，再取出离心管，注意不要扰动梯度界面处的细胞。

在5毫升刻度附近观察梯度界面，此处通常可见一条1-2毫米厚的白色条带。用真空负压吸除并弃去梯度上层7毫升液体，以便更方便地用移液器接触界面。通过持续的手动吸力并配合稳定旋转手腕的动作，收集界面层的细胞。收集至两层梯度之间的界面变得清晰且有折光性为止，并将界面层转移至一个新的50毫升聚丙烯圆锥形管中。