从鸡胚尿囊膜中分离转移性癌细胞克隆：一种从无壳鸡蛋培养物中分离癌细胞的方法

鸡的绒毛尿囊膜（CAM）是一种位于蛋壳下方的三层膜结构，由外层的外胚层、富含血管的中胚层以及最内层的内胚层组成。

CAM 间充质包含血管、成纤维细胞和间质成分，因此为肿瘤细胞定植提供了有利的环境。

为了从CAM中分离定植的癌细胞，首先取一个去壳的卵培养物，该培养物已在培养皿中预先接种了荧光标记的癌细胞。在荧光显微镜下观察卵培养物，找到荧光且致密的转移性癌细胞集落。

轻柔地切除含有目标转移克隆的绒毛尿囊膜（CAM）组织。将切除的CAM组织转移至微量离心管中。将组织切成小块，以便在后续步骤中进行酶处理。

向离心管中加入胶原酶，混匀后孵育。胶原酶可降解CAM中胚层中的胶原蛋白，从而启动癌细胞集落的解离。离心悬浮液，使癌细胞、CAM组织残余物及CAM成纤维细胞沉淀。弃去含有胶原酶的上清液。

加入选择性生长培养基，并将悬浮液转移至新的培养皿中。该培养基可促进悬浮癌细胞的生长，抑制其他细胞的生长。收集癌细胞并储存，用于后续分析。

注射后第5天，从培养箱中取出胚胎，检查并定位胚胎绒毛尿囊膜（CAM）上的转移性克隆分布情况。在解剖显微镜下，用精细镊子轻轻向上提起含有目标转移性克隆的CAM组织，并用手术剪将其剪下。

将CAM组织转移至一个无菌的空1.5毫升离心管中，并盖紧管盖。重复切除操作，直至所有目标菌落均被分别收集到不同的离心管中。使用独立的无菌18G针头对每个菌落的CAM组织在微量离心管中进行轻柔剪切。加入100 µL 1×胶原酶溶液，在37 °C条件下孵育30分钟。

在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，使细胞和 CAM 组织沉淀。吸除胶原酶溶液，并将细胞重悬于目标细胞系的完全培养基中。随后，再次离心细胞和组织。

将细胞和组织碎片重悬于1毫升完全培养基中，如有需要可加入筛选因子。随后转移至一个12孔组织培养板的单个孔中。在接下来的一至三周内，每天观察癌细胞的生长情况及有无污染。当细胞融合度达到70%至80%时，将其转移至更大体积的培养皿中。一旦获得足够的癌细胞数量，立即进行测序或下一轮筛选。