0 次观看 • 3:53 分钟 • April 30th, 2023
对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行预处理有助于暴露核酸，并在后续原位杂交过程中促进标记探针与靶序列的结合。此外，预处理有助于维持细胞内核酸的完整性以及整体组织形态。
首先，取一张载有已脱蜡和复水的FFPE组织切片的玻片。用适当浓度的过氧化氢处理组织，并进行孵育。
过氧化氢可不可逆地灭活细胞中生理存在的内源性过氧化物酶。该阻断步骤消除了后续杂交步骤中产生非特异性背景信号的可能性。
接下来，将组织切片浸入含有适当抗原修复缓冲液的加热浴中，孵育所需的时间。高温可断裂固定剂诱导的蛋白质和核酸中的化学交联，从而在后续标记过程中使探针暴露于去屏蔽的抗原表位。
最后，用适当的蛋白酶溶液处理样本，在可控湿度环境中孵育。蛋白酶可提高RNA的可及性，有助于后续杂交步骤中特异性探针与目标序列结合。
用清水洗涤切片，以去除任何残留的蛋白酶。使用预处理后的组织切片进行RNA显色原位杂交。
为了阻断已脱蜡并置于载玻片架中的组织切片上过氧化物酶的活性，向每张载玻片加入4至6滴过氧化氢，用量以恰好覆盖样本为宜，并在室温下孵育10分钟。用蒸馏水在室温下洗涤载玻片两次，每次2分钟。为了打断RNA与组织的结合以及组织切片结构，首先使用钳子移除沸水浴中TRR1x容器外的铝箔，并停止搅拌。
将载玻片架缓慢且非常小心地浸入。再次用铝箔覆盖烧杯，并孵育15分钟。使用镊子立即将热的载玻片架转移至蒸馏水浴中，清洗2分钟。随后将载玻片在新鲜的100%乙醇中清洗2分钟，并在室温下晾干2分钟。
接下来，使用疏水屏障笔在每个样本周围画出屏障，并使其干燥至少5分钟。进行蛋白酶消化时，将载玻片放入湿度控制托盘中，每个样本加入约4滴Protease Plus。盖上托盘盖子，放入杂交炉中，在40摄氏度下孵育30分钟。
从烤箱中取出托盘并取出载物架。每次处理一张载玻片，迅速去除多余的液体，并将载玻片放入盛有蒸馏水的染色缸中的载物架上，确保载玻片完全浸没。在室温下用蒸馏水洗涤载玻片两次，每次2分钟，持续搅动。