肿瘤侧群细胞鉴别实验：利用Hoechst染料外排实验分离肿瘤干细胞样细胞的方法

肿瘤中含有少量具有干细胞特性的细胞，称为侧群细胞。这些细胞具有化学抗性，是导致癌症复发的原因。

为了分离癌症细胞中的侧群细胞，首先将Hoechst（一种荧光染料溶液）加入含有癌细胞悬液的小瓶中。在正常的癌细胞内，Hoechst分子进入细胞核并与DNA中的A-T富集区结合，导致这些细胞产生强荧光。

相比之下，侧群细胞含有高浓度的ABC转运蛋白——这些外排泵能够快速将染料分子从细胞内排出。这种染料分子的主动外排作用使得侧群细胞的荧光强度较低。

现在，取另一管经 Hoechst 处理的癌细胞，并加入维拉帕米。此管作为对照，因为维拉帕米可阻断 ABC 转运蛋白。该步骤可减少 Hoechst 的外排，使染料保留在侧群细胞内。

接下来，使用碘化丙啶对两个小瓶中的细胞进行复染。碘化丙啶只能进入死细胞的细胞核，并嵌入DNA碱基对之间，从而导致死细胞产生强烈的荧光。

最后，使用荧光激活细胞分选仪（FACS）对细胞进行分选。FACS 可将高荧光、保留 Hoechst 的肿瘤细胞和死细胞与低荧光的侧群细胞分离开来。

通过Hoechst染料外排实验筛选癌干细胞样细胞亚群时，首先标记一个锥形管为“Hoechst”，另一个为“Hoechst和维拉帕米”。接着，用无菌PBS洗涤HNSCC细胞培养物，然后加入1毫升胰蛋白酶-EDTA溶液。在37摄氏度作用3分钟后，加入新鲜细胞培养基终止反应，并对细胞进行计数。用完全培养基将细胞悬液稀释至每毫升含1×10⁷个细胞。

然后，向“Hoechst 和 Verapamil”管中加入 100 微升，向“Hoechst”管中加入 4 毫升细胞。接着，将 10 微升 5 毫摩尔的盐酸维拉帕米溶液轻轻混入“Hoechst 和 Verapamil”样品中，随后向两管中每 1 × 10⁶ 个细胞加入 5 微升 Hoechst 染料。然后用铝箔包裹样品，并置于 37°C 条件下。每 15 分钟轻柔混匀一次，孵育 90 分钟后，离心收集细胞，并将沉淀重悬于 2 毫升 PBS 中。

经过第二次离心后，将“Hoechst 和 Verapamil”沉淀重悬于 500 微升含碘化丙啶的 PBS 溶液中，将“Hoechst”沉淀重悬于 4 毫升相同的溶液中。接着，将样品通过 70 微米细胞滤网过滤至流式管中，以去除任何聚集体，并将样品置于冰上避光保存。然后，将“Hoechst”样品上机至流式细胞仪，在流式细胞仪软件中打开“Global Worksheet”窗口。点击“Dot Plot”在全局工作表中创建图表，右键选择前向散射和侧向散射参数。

以侧向散射宽度对侧向散射高度创建点图，方法相同，然后单击“多边形门控”工具，在第二个图中创建P1区域，以选择单细胞并区分双联体。接下来，创建红荧光Hoechst面积对蓝荧光Hoechst面积的点图，右键单击细胞以高亮显示P1细胞群。然后创建P2区域，选择位于主细胞群左侧、呈侧臂状分布的Hoechst染料阴性细胞亚群，并收集10,000个“Hoechst”样本事件。

为了确认代表侧群的 P2 门位置正确，还需收集 10,000 个“Hoechst 和维拉帕米”样本事件。此时侧群应消失。随后，将 Hoechst 染料阴性细胞的侧群分选至含有 1 毫升完全培养基的 15 毫升圆锥形试管中。分选结束后，离心细胞，并将侧群细胞沉淀重悬于 1 毫升新鲜的完全肿瘤干细胞样细胞培养基中。然后对细胞进行计数，并以适当密度接种至新的细胞培养瓶中。