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外泌体是细胞分泌到生物体液中的细胞外囊泡结构。要从生物体液中捕获特定的外泌体,首先将链霉亲和素包被的磁珠放入管中。
向该管中加入生物素化的抗人抗体。抗体上存在的生物素对磁珠上存在的链霉亲和素具有高亲和力。这导致抗体与磁珠偶联。
接下来,将富含蛋白质的封闭溶液添加到含有抗体标记磁珠的试管中。封闭溶液中的蛋白质与磁珠上的游离位点结合,增加外泌体结合的特异性。
现在,用富含外泌体的样品生物流体补充管。在搅拌下孵育管。生物流体中的外泌体显示出特定的表面受体,这有助于它们与附着在磁珠表面的抗体结合。
接下来,将管子置于磁场中。在磁场的影响下,外泌体结合的磁珠附着在管子表面。然后,使用微量移液器从管中吸出剩余的生物液。
最后,将管子从磁场中取出并添加合适的缓冲液以洗脱外泌体结合的珠子。这些外泌体结合的磁珠可用于进一步的下游分析。
重
悬含有每毫升链霉亲和素包被磁性微粒10微克的储备溶液,并将5微升溶液加入含有495微升PBS的微量离心管中。要清洗珠子,首先,将试管放在磁架上 1 分钟,然后小心地取出缓冲液,不要干扰珠子。
然后,将管子转移到非磁性架上。加入 500 微升 PBS 并移液器洗涤珠子。总共这样做三次。最后洗涤后,将珠子重悬于 490 微升 PBS 中,然后从每毫升 1 毫克储备溶液中加入 5 微升生物素化小鼠抗人 CD63 抗体。
通过移液混合溶液。对样品旋转器进行编程,使其以 90 度往复旋转 5 秒,以 5 度振动 1 秒。将试管放入旋转器中,并在室温下运行程序 30 分钟。
接下来,将试管转移到磁架上 5 分钟。用 500 微升 PBS 洗涤珠子 3 次,然后将它们重悬于 490 微升含有酪蛋白的 PBS 中。在试管上标记样品标识,然后加入 10 微升样品。
移
液数次,将样品与抗体偶联的珠子混合。接下来,将试管转移到样品旋转器上,并在室温下运行相同的程序 2 小时。然后,使用磁化架用 500 微升 1M Tris-盐酸盐缓冲液洗涤珠子 3 次。外泌体现在与磁化珠结合。