从唾液腺组织培养唾液球：一种由人唾液腺来源的上皮细胞生成唾液球的方法

唾液球是源自唾液腺的上皮细胞在体外自发聚集形成的细胞培养物。培养唾液球时，首先将人唾液腺组织置于培养板中。

使用剪刀将组织剪切成细小碎片。接着，向这些碎片中加入含有胶原酶和分散酶的消化液并进行孵育。这些酶可降解组织中存在的细胞外基质。

进一步研磨以使组织均质化。此步骤可将上皮细胞和红细胞释放到溶液中。接着，使用细胞筛将组织匀浆过滤至新的锥形管中，以去除未消化的组织碎片和残渣。离心以沉淀细胞。

离心后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于红细胞裂解缓冲液中。该缓冲液可裂解细胞悬液中存在的红细胞。

现在，离心以沉淀上皮细胞。将沉淀物重悬于适当的上皮细胞培养基中。此外，通过在孔中包被液化的基底膜基质（BMM）来制备唾液球培养板。孵育以使基质凝固。

最后，将上皮细胞悬液加入经BMM包被的孔中。在生长培养基存在下，上皮细胞会附着于BMM层，并增殖形成球形的唾液腺球（salispheres）。

在从患者体内取出后的两到四小时内，于培养皿中使用经高压灭菌的解剖剪和外科镊子将唾液腺组织剪切成大小为1至2毫米的细小组织块。向剪碎的组织中加入6毫升dispase/胶原酶消化液，随后在37摄氏度下孵育约30分钟至1小时。

用5毫升血清学移液管吹打组织15至20次，以充分破坏组织。在37摄氏度下再孵育30分钟至1小时。重复吹打和孵育步骤两到三次，或直至组织呈糊状并能轻松通过移液管开口为止。

为了用BMM包被孔板，将500微升经前夜解冻的BMM缓慢移液至6孔板的每个孔中。缓慢摇晃孔板，使BMM均匀分布于各孔。随后，将包被好的孔板在37摄氏度孵育至少15分钟，以使BMM凝固，之后即可使用。

将含有匀浆组织的dispase/collagenase溶液转移至15毫升锥形管中。用6毫升DPBS洗涤培养板壁一次，以将残留的细胞转移至锥形管中。随后，通过70微米尼龙网细胞滤筛，将匀浆液过滤至新的50毫升锥形管中，以去除未消化的组织。

将过滤后的细胞在500 × g 条件下离心5分钟。吸除上清液。然后，将细胞沉淀重悬于10毫升1×红细胞裂解缓冲液中。在37摄氏度孵育5分钟。随后，加入20至25毫升DPBS以中和红细胞裂解缓冲液，减少唾液细胞的裂解。

在500 × g 条件下离心5分钟。白色细胞沉淀表明所有红细胞已完全裂解。如果沉淀呈红色，则用红细胞裂解缓冲液重复处理。吸除上清液，并将沉淀重悬于1至2毫升BEGM中，然后将重悬的细胞转移至BMM包被的孔中。

在37摄氏度下孵育。接种到BMM上后，细胞将在两到三天内形成球形结构或唾液腺球。细胞可作为唾液腺球维持约五到七天，之后BMM开始降解，使细胞能够接触并黏附于塑料表面，以单层形式生长。