细胞外DNA染色：一种用于鉴定福尔马林固定石蜡包埋组织切片中细胞外DNA的方法

将死亡的细胞会释放一部分细胞外的DNA，称为游离DNA。为了染色游离DNA，首先取置于载玻片上的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片。将载玻片加热至所需时间。此步骤有助于组织附着在载玻片表面，并软化周围的石蜡。

将切片浸入脱蜡液中，以彻底溶解组织周围的石蜡层。接着，将切片依次浸入浓度递减的乙醇溶液中，使脱蜡后的组织重新水化。水化完成后，将切片浸入煮沸的抗原修复液中。该处理可暴露在固定过程中发生改变的抗原表位。

将一抗覆盖于切片上，使其与细胞表面暴露的特异性表位结合。随后加入荧光标记的二抗，使其与一抗结合。将切片浸入苏丹黑溶液中，以降低背景自发荧光。

最后，在组织切片上滴加含有 DAPI 的封片剂，并用盖玻片封片。孵育以使 DAPI 分子对 DNA 进行染色。使用荧光显微镜观察制备好的组织切片。细胞中荧光标记的表位有助于区分细胞内的核 DNA 与细胞外的 DNA。

进行细胞外DNA染色时，首先将载玻片架中的待测样品在60摄氏度下加热60分钟，然后在通风橱中将载玻片浸入溶剂中，每次40分钟，共更换两次溶剂。第二次浸入后，将样品先后在100%乙醇中再水化两次，每次5分钟，随后在70%乙醇中再水化一次，每次5分钟。

最后一次处理后，使用镊子将载玻片放入高压锅内的沸腾抗原修复液中，高温加热10分钟。抗原表位暴露完成后，将高压锅从热源上移开并放入水槽中，立即用冷水冲淋锅盖。

将切片在抗原修复液中平衡20分钟，然后在轨道摇床上用0.01摩尔PBS洗涤样品两次，每次5分钟。第二次洗涤后，使用疏水性笔在肾组织样品周围画圈，并在室温下用60微升含10%鸡血清的5%牛血清白蛋白溶液封闭非特异性染色，封闭时间为30分钟。

孵育结束后，在湿盒中，于 4 摄氏度下用 60 微升目标一抗溶液过夜替代封闭液。次日早晨，在轨道摇床上用 PBS 洗涤切片，每次洗涤 2 分钟，随后每张切片加入 60 微升相应的荧光素偶联二抗溶液，在室温下孵育 40 分钟。

孵育结束后，按照所示方法用 PBS 洗涤载玻片，随后用含 70% 乙醇的 0.3% 苏丹黑处理，以淬灭可能由甲醛引起的自发荧光。30 分钟后，用自来水洗涤载玻片以去除任何沉淀物，并将载玻片浸入 PBS 中 10 分钟，以防止进一步形成苏丹黑沉淀。

孵育结束后，将载玻片用含DAPI的封片液（每滴360 µL）封固于共聚焦显微镜盖玻片上，并用指甲油密封盖玻片。室温下避光静置24小时使其充分固化。随后将载玻片置于4 °C避光保存，直至按照标准操作流程进行共聚焦激光扫描显微成像。