外泌体分离:一种基于密度的超速离心技术，使用蔗糖垫将外泌体与培养细胞的条件培养基分离

外泌体 - 携带功能性生物分子的纳米大小的膜结合囊泡 - 由大多数细胞类型主动分泌，并且可以从体外细胞培养上清液中分离出来。要分离外泌体，首先，从感兴趣的细胞培养物中收获上清液或条件培养基。条件培养基将包含外泌体、蛋白质、细胞碎片和囊泡。

心培养基以沉淀细胞碎片。收集含有外泌体的上清液并通过细胞过滤器过滤以去除较大的囊泡。将特定体积的过滤介质转移到新鲜管中。接下来，混合适当浓度的蔗糖和氧化氘以制备蔗糖垫 - 蔗糖的不连续梯度。

将特定体积的蔗糖垫溶液加入含有培养基的管中;溶液在底部形成单独的层。现在，高速离心管。蔗糖垫促进外泌体从培养基迁移到蔗糖溶液，同时保持外泌体完整性。高密度蛋白质污染物占据蔗糖溶液和培养基之间的界面。

小心地将含有外泌体的蔗糖层的主要部分转移到带有合适缓冲液的新鲜管中。高速离心以获得纯化外泌体的沉淀。丢弃含蔗糖的上清液以及任何蛋白质污染物。将外泌体沉淀重悬于缓冲液中，并在低温下储存直至进一步使用。

要预清除收集的条件培养基，请在 4 摄氏度下以 500 x g 离心 5 分钟。将上清液转移到新管中并丢弃沉淀。用回收的上清液重复此离心步骤后，再次回收上清液并丢弃沉淀。

然后，将回收的上清液以 2,000 x g 离心 15 分钟和 4 摄氏度。保留上清液并丢弃沉淀。将上清液通过连接到 20 毫升注射器的 0.22 微米过滤器过滤到新鲜的离心管中一次。

同时，要制备25%的氧化氘蔗糖溶液，在万能管中精确称取1.9克蔗糖。然后，加入氧化氘，直到重量达到7.6克。然后，用 22.5 毫升预先清除的条件培养基填充超速离心管。

将玻璃移液器放入管中。通过移液器加入 3 毫升蔗糖溶液，使溶液在条件培养基下方形成单独的层。小心地将装有分层条件培养基蔗糖溶液的试管放入摆动转子的桶中。

铲斗固定到转子中。将转子放入超速离心机中，在 4 摄氏度下旋转 100,000 x g 1.5 小时。使用P1000移液器将其尖端连接到10微升的尖端，从管中收集2毫升蔗糖层，一次1毫升，并将其添加到装有20毫升过滤PBS的超速离心瓶中进行洗涤。

试管放入固定角转子中，并在 4 摄氏度下以 100,000 x g 离心 1.5 小时。使用 10 毫升血清移液器小心地去除上清液。用 400 微升过滤的 PBS 重悬沉淀。