基于反向蛋白相阵列的蛋白质表达分析：一种同时定量细胞裂解液中多种蛋白质表达水平的方法

肿瘤样本中含有多种不同的蛋白质。利用肿瘤裂解液，可同时平行分析其中的多种蛋白质，以鉴定目标蛋白质。这种高通量技术称为反相蛋白质微阵列（Reverse Phase Protein Arrays，RPPA）。

进行反向蛋白微阵列（RPPA）时，首先取一块涂有硝酸纤维素的免疫测定玻片。将肿瘤裂解液蛋白阵列点样到玻片上。孵育以使蛋白被硝酸纤维素捕获。随后，用封闭缓冲液处理玻片，以封闭蛋白上的非特异性抗体结合位点。

去除多余的封闭液。现在将包被有蛋白质的玻片放入支架中，并紧密封合，以在玻片表面形成临时的微孔。接着，向微孔中加入一抗溶液。这些抗体能够识别芯片上蛋白质混合物中相应目标蛋白所含的表位。

最后，加入荧光标记的二抗。这些二抗会与预先结合的一抗结合，形成复合物。洗涤玻片以去除未结合的二抗。将玻片从支架上取下，使其自然晾干。

使用荧光扫描仪扫描玻片。带有抗体标记的靶蛋白会在特定波长下发出荧光，在玻片表面呈现为彩色斑点。

在进行RPPA点样前，需对每个样本进行连续五次两倍稀释。该流程中最耗时的步骤之一是完成数百个稀释操作。为确保实验成功，在点样玻片前应仔细核对所有稀释样本。

然后使用 MicroGrid II 机器人点样仪将蛋白质裂解液点样到硝酸纤维素包被的玻片上。每个样本重复点样三次，每个样本共产生 15 个点。本实验所用玻片包含两个点样区域，样本被点样于这两个区域上。每个区域点样相同的样本，在本例中为 100 个样本。其他可用的玻片格式包括 1、8 和 16 个点样区域的玻片。点样区域数量越多，每个区域可点样的样本数量就越少。

开始蛋白质检测实验时，将载玻片浸入过量的封闭缓冲液中，并在室温下于摇床上孵育1小时。根据所需浓度，用封闭缓冲液配制800微升的一抗溶液，并置于冰上保存。在封闭缓冲液中孵育1小时后，将载玻片安装至单孔芯片夹（Chip Clip）或四孔快速框架（FastFrame）载玻片支架中，确保载玻片与孵育腔室之间形成严密的密封。

从孔中移除残留缓冲液，并向各孔中加入600微升一抗。将载玻片和孵育盒放入密封的湿盒中，于4摄氏度在摇床上孵育过夜。次日早晨，从冷藏室中取出载玻片，小心移除各孔中的一抗。加入600微升0.1% PBS-Tween20（或PBS-T），在室温下于摇床上洗涤载玻片5分钟。

用新鲜的 PBS-T 替换原有的 PBS-T，共洗涤载玻片三次。移除孔中的缓冲液，并向各孔中加入 600 微升适当稀释的荧光标记二抗。在室温下轻轻振荡孵育 45 分钟。从孵育开始直至扫描前，必须注意避光保护膜。45 分钟后，移除二抗溶液，并用 600 微升 PBS-T 在室温下短暂洗涤三次。

从载片架中取出载片，转移至合适的容器中，并用过量的 PBS-T 在避光条件下洗涤 15 分钟。弃去 PBS-T，再用 PBS 在室温下洗涤膜 15 分钟以去除残留的 Tween20，同样需保持避光。将 Fastslides 置于 50 摄氏度的烘箱中干燥 10 分钟。最后，根据所使用的二抗情况，在 680 纳米和/或 800 纳米波长下扫描载片。