从小鼠肾小球中吸取液体：一种利用双光子介导显微穿刺从小鼠肾小球吸取肾小球液的方法

在肾脏中，肾小球——即包裹于肾小囊内的毛细血管丛——启动血液滤过过程，并将废物液体排入周围的肾小囊腔。对肾小球滤过液成分的研究有助于理解肾脏生理学。

为了吸取肾小球滤液，先准备一只已麻醉的小鼠，并将其肾脏通过手术暴露于体外。接着，将荧光标记的葡聚糖染料注射到小鼠眼眶后方的血管中。荧光葡聚糖分子随血流运行并到达肾脏。

由于葡聚糖具有高分子量，荧光染料被保留在肾小球内，使其呈现绿色。在双光子显微镜下（该显微镜可观察深层结构），定位一个合适的肾小球，以充分接触肾小球液。

接下来，将涂有红色荧光纳米颗粒的微移液管尖端与肾脏的外侧轴对齐。使用显微操作仪推进移液管尖端，使其穿透肾脏。当尖端到达目标肾小球时，设定所需的抽吸速率，从鲍曼氏囊腔中抽取肾小球滤液。

红色移液吸头内无绿色荧光表明未发生出血，证实肾小球液体吸取成功。随后，撤出移液吸头，并将液体储存在适当的缓冲液中以供进一步分析。

确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将眼膏涂抹于眼睛，并用胶带固定20至25克成年小鼠的四肢。使用脱毛膏去除动物左侧全部毛发，并通过脾脏定位位于脾脏背侧和尾侧皮下的左肾。

在皮肤上做一个0.5厘米的切口，接着在腹膜上做一个较小的切口，切口大小以刚好能将肾脏推出为宜。轻轻施压使肾脏突出，然后在组织周围放置一个聚硅氧烷肾脏稳定模具。将肾脏与垫片对齐，使肾脏最外侧表面超出稳定器约1毫米，并用氰基丙烯酸酯粘合剂将肾脏固定在模具上。将头部固定板粘接到稳定器模具上，再将头部固定板安装到基板的固定杆上。

接下来，将1%琼脂糖溶液注入聚硅氧烷支撑体的孔中，并在模具上方放置一个10毫米的盖玻片，直至琼脂糖凝固。用胶水将盖玻片密封至头板，并用牙科水泥在盖玻片周围形成一圈密封环。然后，经眼后静脉注射100至150微升FITC-葡聚糖，并迅速将小鼠和固定板转移至双光子显微镜载物台上。

手动对焦至肾脏表面后，切换至非扫描式双光子模式，探索成像视野，定位一个位于盖玻片下方超过30微米且距离肾脏侧包膜不到400微米的目标肾小球。记录目标肾小球的横向和纵向距离。然后，记录该肾小球的x、y和z轴载物台坐标，最后，在不改变x和y轴载物台坐标的情况下，将物镜焦点向上提升约1毫米进入水柱中。

将移液器尖端插入水柱中，并开启DAPI激发光源。在X和Y方向上移动移液器，使其尖端到达荧光最强的位置，此位置即为物镜的中心。将激发光源设置更改为红色荧光蛋白，通过目镜观察移液器，以便在目镜视野中实现精确居中。

切换回双光子模式，在实时双光子视野下找到移液管，并将管尖精确置于图像中心。此位置即为定位位置。随后，保存移液管的图像，并记录载物台和微移液管控制器的坐标。在不移动 y 轴和 z 轴的情况下，将移液管沿 x 轴从水柱中移出，然后将移液管的 Z 轴移动至目标肾小球的 Z 坐标以及肾脏边缘。

记录载物台 X 位置，并根据注册载物台的偏移量 X 计算肾脏边缘对应的移液管 X 位置。增大载物台 X 值，将载物台向移液管方向移动，直至肾脏边缘位于屏幕左侧较远处但仍可见。迅速将移液管推进至距离此前计算的肾脏边缘对应移液管 X 位置约 100 微米处。提高红色增益，并在实时双光子成像下缓慢推进移液管尖端接近肾脏边缘，同时监测红色像素直方图。

缓慢沿x轴推动移液管至肾小球目标移液管X位置，同时密切关注载物台X坐标。到达肾小球后，用Z轴层扫记录位置。移液管就位后，设置微量泵在2分钟内注入100纳升全氟十氢萘，以确保移液管通畅，并减少进入过程中因移液管堵塞造成的干扰。过滤4至6分钟后，设置微量泵以每分钟最多50纳升的速度抽吸最多300纳升液体。