小胶质细胞吞噬作用检测：利用iPSC来源的巨噬细胞建立针对神经母细胞瘤细胞的体外小胶质细胞吞噬模型

小胶质细胞是大脑中的巨噬细胞，通过一种称为吞噬作用的过程，帮助清除病原体、细胞碎片以及癌变的神经细胞或神经母细胞瘤。

为了在体外模拟吞噬作用，首先使用经多聚甲醛固定的神经母细胞瘤细胞培养物。

多聚甲醛是一种化学固定剂，可导致膜磷脂（如磷脂酰丝氨酸）发生随机分布，使其易位至细胞膜外表面，同时稳定细胞结构。

现在，向神经母细胞瘤细胞培养物中加入一种对 pH 敏感的胺反应性荧光染料，并进行孵育。

染料分子结合到神经母细胞瘤细胞表面磷脂酰丝氨酸的氨基基团上。

离心试管并弃去含有未结合染料分子的上清液。用适当的缓冲液冲洗细胞沉淀，然后离心。

弃去上清液，并将沉淀重悬于培养基中。

接下来，将预先染色的巨噬细胞接种于培养板中。染色后的巨噬细胞呈红色，细胞核为蓝色。

将染色的神经母细胞瘤细胞加入该培养物中并孵育。

巨噬细胞的吞噬受体识别神经母细胞瘤细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸，并将其内化至称为吞噬体的膜包被区室中。

吞噬体会迁移并与溶酶体融合，使神经母细胞瘤细胞暴露于溶酶体的低pH环境中。低pH会激活神经母细胞瘤细胞上的染料分子，导致染料颜色发生变化。

在荧光显微镜下，被巨噬细胞吞噬的神经母细胞瘤细胞在红色巨噬细胞内呈现黄色。

用移液器将SH-SY5Y细胞转移至15毫升圆锥形离心管中。在400 × g 条件下离心5分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于2毫升酚红-free HEPES缓冲培养基中，固定前务必充分分散细胞团块。

向离心管中加入 2 毫升 4% 多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育 10 分钟，期间偶尔轻轻振荡。向离心管中加入 10 毫升 HBSS。

然后，在 1,200 ×g 条件下离心 7 分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于 2 毫升不含酚红的 HEPES 缓冲培养基中。计数后取一百万个 SH-SY5Y 细胞，转移至一个 2 毫升低蛋白结合管中。

用不含酚红的 HEPES 缓冲液将总体积调至 300 至 500 微升。然后将离心管在 37 摄氏度水浴中短暂预热。根据生产商说明书重悬 pH 敏感性红色荧光染料 STP 酯。

然后，每百万个 SH-SY5Y 细胞加入 12.5 µg 染料。轻轻弹击离心管混匀，并在避光条件下室温孵育 30 分钟。

加入1毫升HBSS，于4摄氏度下以1,200 ×g离心7分钟。弃去上清液，并用2毫升HBSS洗涤。

将细胞沉淀重悬于不含酚红的巨噬细胞培养基中，调整细胞浓度至每毫升0.2×10⁶至1.2×10⁶个细胞，使50微升体系中含有10,000至60,000个细胞。

在生物安全柜中，用巨噬细胞培养基配制深红色荧光、可穿透细胞膜且能与琥珀酰亚胺酯反应的染料溶液。加入 Hoechst 33342，并将工作液置于水浴中加热至 37 摄氏度。

使用多通道移液器将细胞上清液轻轻吸出，转移至无菌储液槽中，以去除iPSC巨噬细胞培养基。

使用多通道移液器向