从新鲜冷冻胶质瘤组织中分离细胞核：一种获取完整胶质瘤肿瘤样本细胞核的方法

为了分离细胞核，首先取一份新鲜冷冻的胶质瘤样本——一种起源于脑部胶质细胞的肿瘤——置于培养皿中。

将培养皿置于冰上，以避免组织降解。

接下来，将组织样本切成小块。

向切碎的组织块中加入预冷的裂解缓冲液。将混合物转移至Dounce 匀浆器中。用研杵充分匀浆组织，以破碎细胞并启动裂解过程。

现在，将匀浆转移至含有新鲜裂解缓冲液的微量离心管中。

使用宽口移液器吸头机械性地破坏匀浆液。此步骤有助于细胞质细胞器从细胞中释放出来。

随后，使用适当尺寸的细胞筛将匀浆液过滤至新离心管中，以去除组织碎片及其他污染物。

过滤后，收集含有各种细胞器的滤液。

将滤液以低速离心，使较重的细胞核沉淀至管底，而其他细胞器则保留在上清液中。

弃去含有细胞器的上清液。将富含粗提细胞核的沉淀物保存在适当的储存缓冲液中，用于后续测序分析。

将10至60毫克新鲜冷冻组织样本转移至预冷的培养皿中。在冰上用刀片将新鲜冷冻组织切成小块。向培养皿中的组织加入500微升预冷的细胞核裂解缓冲液。

然后，将混合物转移至Dounce匀浆器中。使用“松”型研杵研磨组织块约20次，直至摩擦阻力减小。接着，换用“紧”型研杵继续研磨 用研钵研磨20次，以实现完全的组织匀浆。

将匀浆液转移至预冷的2毫升离心管中，向Douncer匀浆器中加入1毫升预冷的裂解缓冲液冲洗，随后将冲洗液也加入该离心管中。轻轻混匀，冰上孵育5分钟，在孵育期间用宽口移液器吸头轻柔吹打1至2次。

使用30微米的滤网过滤整个匀浆液，并将其收集到15毫升的Falcon管中。然后将其转移回一个新的预冷的2毫升离心管中。通常情况下，一个滤网足以过滤全部匀浆液。

在光学显微镜下检查样本，以确认大块碎片已被去除且核膜完整。细胞核无需呈圆形，且核膜不应出现扭曲。若存在碎片，请重复过滤步骤。

接下来，在台式离心机中离心细胞核5分钟。弃去上清液，留下约50微升含有细胞核的沉淀。将沉淀轻轻重悬于1毫升细胞核裂解缓冲液中，置于冰上孵育5分钟。

重复离心操作。然后，在不扰动沉淀的前提下，弃去上清液。加入500毫升HB缓冲液，将样品在不重悬的情况下孵育5分钟。随后，用另取的1毫升HB缓冲液重悬细胞核。

再离心5分钟。然后，弃去上清液。用200 µL HB重悬细胞核，并将悬液转移至新的2 mL离心管中。