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癌症研究
0 次观看 • 4:00 分钟 • April 30th, 2023
蛋白质的泛素化是指通过泛素（一种调控性小蛋白）的双甘氨酸残基，将其连接到底物蛋白的赖氨酸残基上。这会在底物蛋白与泛素之间形成一个赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸连接。
为了分离泛素化标记的肽段，首先取肽段混合物。
用内切核酸酶酶混合物处理这些肽段。在处理过程中，酶Lys-C和胰蛋白酶在精氨酸残基处高效切割泛素化肽段，产生含有特征性二甘氨酸基序的肽段片段。
将这些肽片段加入抗体偶联的水凝胶微球悬液中。
这些抗体含有一个甘氨酸二聚体识别位点，可特异性结合泛素化肽段，形成肽-磁珠复合物。
离心以沉淀泛素化肽-珠复合物。弃去含有未泛素化肽的未结合上清液。
将复合物上样至滤膜装置中。离心以去除缓冲液并截留肽偶联的微珠。
加入酸化试剂以降低 pH 值，使肽段从磁珠上解离下来。
从滤液中回收游离肽。将它们加载到带有疏水基质的新滤器上。肽保留在基质中，而酸性盐被洗去。
使用合适的溶剂，使肽脱离。
将泛素化肽转移至新的离心管中，并干燥以去除任何残留的溶剂。
将一批与蛋白A琼脂糖珠悬液偶联的泛素化残基基序抗体均分为六等份。按照文稿中的说明溶解三个肽段组分，并离心去除碎片。
将三个组分的上清液加入珠子悬液中，同时将另外三个组分置于冰上，并在4°C下于旋转仪中孵育2小时。
然后，离心沉淀珠子。将上清液转移至新的一批珠子中，并与剩余的三份珠子悬液依次重复孵育步骤。
将上清液保存用于后续的全局蛋白质组分析，并将珠子转移至装有GF/F滤芯插头的200微升移液器吸头中。
将枪头放入配有离心管适配器的1.5毫升离心管中，用200 µL预冷的IAP缓冲液洗涤磁珠三次，随后用预冷的纯化水再洗涤三次。
每次洗涤之间，以200 × g 离心2分钟，确保柱子不干涸。最后一次洗涤后，用两轮各50 µL的0.15% TFA洗脱肽段。使用C18固相萃取小柱对肽段进行脱盐，并通过真空离心干燥。