为什么零假设检验对于泛素化肽段的富集具有重要意义？

零假设检验可确保观察到的泛素化肽段富集具有统计学显著性，从而支持可靠的目标验证，并减少翻译后修饰位点鉴定中的假阳性结果。

自变量隔离如何融入免疫亲和工作流程？

分离抗体特异性和肽段输入等变量，可使研究团队将富集结果直接归因于免疫亲和步骤，从而增强对实验流程机制的信心。

定量因变量测量在肽段提取中能够实现什么？

对肽段回收率和修饰位点丰度进行定量测量，可实现不同条件间的比较分析，为后续筛选和转化研究决策提供依据。

为什么复制要求对于跨功能蛋白质组学团队至关重要？

重复实验可确保肽段富集与鉴定在不同实验和团队之间具有可重复性，从而支持研发流程中可靠的数据整合与协作决策。

在实施肽段富集方案之前，需要具备哪些统计分析能力？

团队必须能够使用适当的统计学方法评估富集效率、特异性和可重复性，以验证该方案是否适用于高置信度的蛋白质组学研究。

基于免疫亲和的泛素化肽提取:一种从纯化的肽组分中选择性提取泛素标记肽的技术

JoVE Encyclopedia of Experiments

癌症研究

0 次观看 • 4:00 分钟 • April 30th, 2023

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蛋白质泛素化的特征是通过其二甘氨酸残基将泛素（一种调节性微型蛋白质）添加到底物蛋白的赖氨酸残基中。这在底物蛋白和泛素之间产生赖氨酸-甘氨酸-甘氨酸键。

要分离泛素标记的肽，首先服用肽混合物。

用核酸内切酶混合物处理这些肽。在处理过程中，Lys-C 酶和胰蛋白酶有效地裂解精氨酸残基处的泛素化肽，从而产生含有标志性二甘氨酸基序的肽片段。

将

这些肽片段添加到抗体偶联的水凝胶珠浆中。

这些抗体含有一个二甘氨酸识别位点，该位点仅与泛素化肽结合，形成肽-珠复合物。

离

心以沉淀泛素化肽-珠复合物。除去未结合的非泛素化肽含上清液。

将复合物加载到过滤器组件上。离心以去除缓冲液并捕获肽偶联的珠子。

添加酸化试剂，降低 pH 值，导致肽与珠子脱离。

从滤液中回收游离肽。将它们加载到带有疏水基质的新过滤器上。肽保留在基质中，而酸性盐被冲走。

使用合适的溶剂，分离肽。

将

泛素化肽转移到新鲜管中并干燥以去除任何溶剂痕迹。

将一批与蛋白 A 琼脂糖珠浆偶联的泛素残余基序抗体分成六个相等的部分。根据手稿方向溶解三个肽组分并旋转碎片。

将

三个馏分的上清液加入珠浆中，同时将其他三个馏分保持在冰上，并在旋转装置上在4摄氏度下孵育2小时。

然后，旋转珠子。将上清液转移到一批新鲜的珠子中，并与剩余的三个珠浆馏分重复孵育。

储存上清液以进行后续的全局蛋白质组分析，并将珠子转移到配备 GF/F 过滤塞的 200 微升移液器吸头中。

将

吸头放入装有离心吸头适配器的 1.5 毫升管中，用 200 微升冰冷的 IAP 缓冲液洗涤珠子 3 次，然后用冰冷的纯净水洗涤 3 次。

在

两次洗涤之间以 200 x g 旋转色谱柱 2 分钟，确保不要让色谱柱干涸。最后洗涤后，用 50 微升 0.15% TFA 的两个循环洗脱肽。用 C18 阶段吸头对肽进行脱盐，并通过真空离心将其干燥。