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癌症研究
0 次观看 • 3:37 分钟 • April 30th, 2023
小胶质细胞以细胞外囊泡（EVs）的形式向体外培养基中释放免疫介质，包括较大的凋亡小体和较小的微囊泡。
为了分离EVs，首先获取小胶质细胞的条件培养基。该培养基中含有小胶质细胞以及释放的EVs。通过离心将培养基中的细胞沉淀下来。
将含有细胞外囊泡（EVs）、碎片和蛋白质聚集体的上清液收集到新的离心管中。 再次离心以去除细胞碎片和较大的凋亡小体。
将上清液转移至超速离心管中。高速离心。
弃去含有用过的培养基的上清液，并将细胞外囊泡（EV）和蛋白质聚集体沉淀重悬于所需的缓冲液中。
同时，取一根底部带有合适滤膜的尺寸排阻色谱柱。
使用由球形凝胶珠组成的凝胶过滤介质紧密填充色谱柱，该介质可形成具有特定孔径的多孔筛状结构。
将EV和蛋白质聚集体悬浮液加样至固定相顶部。
当悬液流经色谱柱时，较大尺寸的细胞外囊泡（EVs）通过凝胶珠之间的颗粒间隙移动，路径较短；而较小尺寸的蛋白质聚集体则进入凝胶孔内，沿更长的路径迁移。
因此，EVs 会首先从层析柱中洗脱出来。
收集含有EV的组分，并用于后续分析。
将小胶质细胞或巨噬细胞培养物的条件培养基转移至锥形管中，在1,200 ×g下离心10分钟，以沉淀细胞。将上清液转移至新的锥形管中，再离心20分钟，以去除凋亡小体。
然后，将上清液转移至一个10.4毫升的聚碳酸酯管中。将该管放入70.1 Ti转子，于4摄氏度下以100,000 ×g超速离心90分钟，以沉淀EVs。离心后，弃去上清液，并将沉淀物重悬于200微升经0.2微米滤膜过滤的PBS中。
为了分离EVs，通过清洗和灭菌玻璃层析柱并在其底部放置一个60微米的滤膜，制备自制的尺寸排阻层析柱。将交联琼脂糖凝胶过滤基质装填入层析柱中，形成直径为0.6厘米、高度为20厘米的固定相。
然后，用50毫升0.2微米滤过的PBS冲洗固定相。如有需要，可将层析柱在4摄氏度保存以备后续使用。将重悬的EV沉淀加在固定相顶部，并在持续向固定相顶部添加PBS的同时，收集20个连续的250微升组分。这些组分可在-20摄氏度保存。