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癌症研究
0 次观看 • 3:22 分钟 • April 30th, 2023
首先，取一支含有完整细胞外囊泡（EVs）的离心管。
将EVs重悬于所需体积的裂解缓冲液中，并对样品进行超声处理。该处理可裂解EV膜并剪切遗传物质，使蛋白质释放到缓冲液中。
离心以沉淀细胞碎片和剪切的遗传物质。收集含有各种蛋白质的上清液。
向蛋白质提取物中加入上样染料，并在SDS-PAGE凝胶上电泳。
将凝胶浸泡在染色液中，使染料分子与蛋白质结合。找到含有目标蛋白的染色条带并将其切下。
将彩色条带切成小块，以提高后续步骤中酶对蛋白质的可及性。将这些小块转移至微量离心管中。
加入脱色液以去除染色染料。移除用过的脱色液。
加入还原溶液。孵育以使还原剂断裂蛋白质中的二硫键，暴露出游离的巯基。
用烷基化溶液处理还原后的蛋白质。烷基会结合到游离的巯基上，使蛋白质保持去折叠状态。
弃去多余溶液，用脱水溶液洗涤胶块以去除烷基化试剂。将凝胶完全干燥。
凝胶条带现已准备好进行进一步的蛋白质组学分析。
进行蛋白质提取时，将50微升RIPA裂解缓冲液与EV样品在冰上混合5分钟。以500瓦、20千赫兹超声处理样品3次，每次5秒。然后，在4摄氏度下以20,000 ×g离心10分钟，去除囊泡碎片。
分离蛋白质后，在12%聚丙烯酰胺凝胶的浓缩胶中进行蛋白质电泳迁移。室温下用考马斯亮蓝染色液固定凝胶中的蛋白质20分钟。随后，切下每块染色的凝胶，并将其切成小块。
按照文稿中所述，将凝胶条依次进行一系列洗涤。然后，使用真空浓缩仪将其完全干燥。干燥后，在56摄氏度条件下，用含有10毫摩尔二硫苏糖醇的100微升100毫摩尔碳酸氢铵溶液进行蛋白质还原反应，反应时间为1小时。
接下来，在避光条件下，使用含有50毫摩尔碘乙酰胺的100微升100毫摩尔碳酸氢铵溶液进行蛋白质烷基化反应，反应时间为45分钟。按照文稿中的说明洗涤凝胶小块，并在真空浓缩仪中将其完全干燥。