基于颅窗的活体成像技术在小鼠模型中的应用：一种用于研究预注射癌细胞在小鼠脑内行为的成像方法

通过光学成像窗口进行活体成像，可实现对活体动物体内单个细胞在天然微环境中行为的高分辨率追踪研究。

首先，取一只已注射癌细胞且颅窗已植入金属环内的麻醉小鼠，其脑部已预先注射表达核荧光蛋白的癌细胞。 

将小鼠仰卧位放置于成像盒中。成像盒内的磁性固定装置有助于固定已植入的颅窗。

现在，将成像盒转移至倒置显微镜的环境可控成像室中，以分析脑内癌细胞的行为。

在多光子模式下，将激光器设置为合适的波长。聚焦于肿瘤区域，以检测癌细胞的荧光信号。 

为每个位置定义z轴堆栈，以在不同光学层面获取癌细胞的多个活体成像图像。

此步骤可在不影响细胞分辨率的情况下，捕获肿瘤微环境中相当比例的癌细胞。

随后，对肿瘤的不同位置进行长时间的图像采集。

利用合适的软件，在不同的光学平面上追踪癌细胞的运动路径，有助于确定单个肿瘤细胞的迁移行为。

在适当的实验时间点，将小鼠仰卧放置于成像盒中，并将25倍水镜调至最低z位置。在物镜上加入一大滴水，然后将成像盒转移至显微镜的37°C黑暗恒温培养室中。

将物镜移至颅骨成像窗盖玻片处，直至水滴接触盖玻片，然后使用落射荧光模式，通过目镜观察肿瘤，调节至细胞清晰对焦。

将激光器调节至正确的波长，并选择活体成像模式。在选定多个感兴趣的成像位置后，于软件中记录这些位置的坐标。为每个位置定义一个z轴层扫序列，以获取最大体积的肿瘤细胞图像，同时不降低肿瘤细胞的分辨率，图像间的步进尺寸设为3 µm。

然后，每20分钟在不同位置采集一次肿瘤体积的图像，持续2小时，每次采集图像前在物镜上添加水。最后一次图像采集完成后，将小鼠转移至加热垫上并进行监测，直至其完全恢复。