星形胶质细胞分离：一种获取小鼠皮层星形胶质细胞纯品的方法

星形胶质细胞的体外培养有助于研究星形胶质细胞的生物学功能——这是脑内最丰富的细胞类型。

将新生小鼠脑置于解剖显微镜下开始操作。

去除嗅球和小脑。

在两个半球之间沿中线做切口以分离皮层。

去除软脑膜，以避免成纤维细胞和软脑膜细胞对星形胶质细胞培养的污染。

将大脑半球皮层转移至冰上冷的培养基中，并切成小块。

将皮质组织块收集到含有胰蛋白酶的离心管中。胰蛋白酶是一种蛋白酶，可消化细胞黏附蛋白，从而促进细胞分离。

离心以沉淀已消化的组织。

弃去上清液，向沉淀中加入星形胶质细胞培养基。用力吹打以释放出包含星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质前体细胞（OPCs）的混合细胞群体。

将该细胞悬液接种至多聚赖氨酸包被的组织培养瓶中，并进行培养。

带负电荷的细胞附着在带正电荷的多聚赖氨酸上，并在整個表面生长，形成融合单层。

轻轻振荡培养瓶，使松散附着的小胶质细胞和少突胶质前体细胞脱落。移除含有脱落细胞的上清液。

向星形胶质细胞层中加入胰蛋白酶。收集细胞并离心。

重悬沉淀物，并将星形胶质细胞分装至多个培养瓶中。

最后，通过免疫染色细胞特异性标志物来评估星形胶质细胞培养物的纯度。

将盛有脑组织的培养皿转移至体视显微镜下。随后，用精细镊子夹住每侧脑组织的后端，于半球之间沿中线进行切开，以分离皮层。

然后，将第二把镊子插入已形成的沟槽中，从脑的其余部分剥离皮层的板状结构。

待所有皮层分离后，用精细镊子轻轻将脑膜从皮层上剥离。此步骤可避免脑膜细胞和成纤维细胞污染最终的星形胶质细胞培养物。

将制备好的大脑半球转移至另一盛有预冷HBSS的培养皿中，并置于冰上。依次处理全部四个皮层。最后，使用锋利刀片将每个半球切成四至八个小块。

在无菌条件下，将皮质组织块转移至一个50毫升Falcon管中，并加入HBSS，使终体积达到22.5毫升。然后，加入2.5毫升2.5%胰蛋白酶。

盖上盖子，混匀，并将组织在37摄氏度水浴中孵育30分钟。每10分钟振荡混匀一次。然后，在300 ×g离心5分钟以沉淀皮质组织碎片后，小心弃去上清液。

向沉淀中加入10毫升星形胶质细胞接种培养基，使用10毫升移液器将含有组织的培养基剧烈吹打20至30次，直至获得单细胞悬液。

接着，加入星形胶质细胞接种培养基，调整终体积至 20 毫升，按照标准操作流程使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。

一份四只小鼠幼崽皮质的制备应可获得 10 至 15 × 10⁶ 个解离的单细胞。最后，吸出先前准备好的培养瓶中的多聚-D-赖氨酸，然后将解离的细胞悬液转移至该培养瓶中。

将培养物置于组织培养箱中，37摄氏度孵育2天，然后更换培养基。此后应每隔3天更换一次培养基。

培养 7 到 8 天后，星形胶质细胞应呈现融合状态，表面覆盖有一层小胶质细胞。此时，将 T75 培养瓶置于设定为每分钟 180 转的轨道摇床上震荡 30 分钟，以去除小胶质细胞。

弃去含有小胶质细胞的上清液，或将上清液离心后接种培养。然后，加入 20 毫升新鲜的星形胶质细胞培养基，继续以 240 rpm 振荡培养瓶 6 小时，以去除少突胶质细胞前体细胞。

由于部分少突胶质前体细胞（OPCs）可能无法完全从星形胶质细胞层脱离，需继续手动剧烈振摇1分钟，以防止OPCs污染。再次弃去上清液，或将上清液离心收集于培养板中用于培养OPCs。

用 PBS 清洗剩余的融合星形胶质细胞层两次。吸除 PBS，加入 5 毫升胰蛋白酶-EDTA。在 37 摄氏度的组织培养孵育箱中孵育。

每5分钟检查一次星形胶质细胞的脱落情况，并通过将培养瓶轻击手掌2至3次以促进细胞脱落。

星形胶质细胞从培养瓶脱落之后，加入5毫升星形胶质细胞培养基。在180 × g 条件下离心5分钟，吸除上清液，然后加入40毫升新鲜的星形胶质细胞接种培养基。

一个T75培养瓶的混合皮层细胞在首次传代后，应可获得约1 × 10⁶个富集的星形胶质细胞。