JoVE 实验百科全书
癌症研究
0 次观看 • 8:27 分钟 • April 30th, 2023
为了分离脑血管内皮细胞，首先将收获的大鼠脑组织转移至含有冷缓冲液的培养皿中。
去除小脑和视神经后，将脑组织分为大脑半球，随后将中脑与前脑分离。
去除前脑中含髓鞘的白质和软脑膜，留下脑皮层用于分离微血管。
接下来，匀浆皮层以破碎神经组织及其组分。
离心匀浆以去除细胞碎片和髓磷脂。
随后，用含有胶原酶、分散酶和脱氧核糖核酸酶的消化液处理组织沉淀。
胶原酶和分散酶可消化包埋微血管的细胞外基质，使微血管片段从组织中松脱。脱氧核糖核酸酶则降解裂解细胞所释放的游离DNA。
将适量的消化后匀浆液与合适的密度梯度介质混合，并进行离心。
弃去含有髓鞘和脑实质细胞的最上层，随后弃去上清液。
现在，用消化液处理含有微血管的沉淀物，以充分释放包含内皮细胞和周细胞的微血管片段。
离心悬浮液。将含有微血管片段的沉淀重悬于添加了嘌呤霉素（一种抗生素）的适宜培养基中。
将悬液接种至包被有细胞外基质蛋白的培养板中，孵育。
微血管片段附着在培养板的包被层上。嘌呤霉素可选择性地清除周细胞，而培养基成分则促进内皮细胞的增殖。
取出三只5周龄Wistar大鼠的脑组织，将其转移至一个装有冰冷解剖缓冲液的培养皿中，培养皿置于冰上。
取出不含小脑和视神经的脑组织，然后将每个脑沿中线切开，分离左右大脑半球。
在体视显微镜下进行另一处切割，去除中脑，并将所有前脑组织转移至冰上装有解剖缓冲液的干净培养皿中。
然后，将一个前脑转移至一个新的、盛有冷解剖缓冲液的培养皿中。用镊子夹住前脑，并小心地从前脑边缘剥离脑膜。
随后，将前脑翻转，小心地剥离脑膜，避免撕裂。确保前脑表面的脑膜被彻底清除，并切断残留的视神经。此步骤的目的是去除白质被膜，从而获得一层皮层组织。
首先在边缘处夹住前脑，然后小心地沿表面拖动镊子，注意不要撕裂皮层表面。
然后，将脑组织翻转，检查是否有残留的脑膜或较大的表面血管，确保脑组织完全去除脑膜。
接下来，从三只动物颅骨中取出脑组织后，为保证组织保存和细胞存活，整个解剖过程不应超过2小时。将三只脑的皮层转移至7毫升Dounce匀浆器中的6毫升冷解剖缓冲液中。
随后，使用较大间隙的首个研杵上下吹打10次以解离皮层组织，接着使用较小间隙的第二个研杵上下吹打10次。
然后，将6毫升悬浮液转移至一个新的50毫升Falcon管中，并用24毫升冷解剖缓冲液冲洗Dounce匀浆器。将悬浮液分装到三个Falcon管中，每管相当于一个皮层的量。
随后，在室温下以 1000 ×g 离心 5 分钟。观察沉淀物可见粉红色梯度，代表大脑皮层 匀浆中的微血管部分。
现在，弃去上清液，用含有胶原酶、分散酶、DNase I型和庆大霉素的酶解溶液1毫升，对一个皮质组织的沉淀物进行匀浆处理。
将试管置于摇床中，在37摄氏度下孵育30分钟。然后，取1毫升消化液与10毫升25% BSA/HBSS 1X混合，并轻轻涡旋振荡试管。随后，在室温下以3,600 ×g进行密度梯度离心15分钟，分离各组分。
密度梯度离心后，沉淀物中含有微血管，而上层圆盘中含有髓鞘、脑实质以及残留的微血管。
小心地将上层圆盘和上清液转移至洁净的50毫升Falcon离心管中；注意不要吸出微血管沉淀物。
轻轻涡旋试管，并重复密度梯度离心。在第二次离心过程中，将含有微血管的沉淀物置于 4 摄氏度保存。
经过第二次密度梯度离心后，小心弃去上层碟片和上清液。用1毫升冰冷的1× HBSS重悬并混匀两次离心所得的含有微血管的沉淀物。
接下来，用20毫升冰冷的HBSS 1X洗涤微血管，并在1,000 ×g条件下离心5分钟。然后弃去上清液，注意不要丢失微血管沉淀。
取一个皮质的微血管沉淀物，加入1毫升相同的酶解溶液，轻轻涡旋混匀后进行匀浆。随后，在37°C条件下于摇床中消化微血管1小时。之后，将来自三个皮质的已消化微血管混合至同一管中。
再次将混合物分装至两个50毫升Falcon离心管中，使每管含有相当于一个半皮层组织中提取的微血管。随后，在室温下以1,000 ×g离心5分钟。
在接种微血管之前，从培养箱中取出两个已包被的T75培养瓶，吸除多余的包被液，弃去上清液，并将微血管沉淀物重悬于1毫升ECM中。
用添加了每毫升4微克嘌呤霉素的ECM将每支试管补至10毫升，以启动纯化过程，并将微血管接种至培养瓶中。
然后，将培养瓶放入 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中，使微血管黏附于胶原-纤连蛋白基质。