从斑马鱼幼鱼中分离脑细胞：一种获取完整神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的技术

斑马鱼的大脑由神经元——在信息处理中起重要作用的神经细胞——组成。此外，大脑还包含一群支持性的免疫细胞，包括巨噬细胞和小胶质细胞，它们存在于神经元之间的间隙中。

为了从斑马鱼中分离所有这些类型的脑细胞，首先将含有适当培养基的培养皿中的麻醉斑马鱼幼虫取出。

在体视显微镜下观察斑马鱼幼体，并在卵黄囊上方横切幼体头部，以保持脑组织完整。

将切除的头部转移到装有预冷培养基并置于冰上的匀浆器中。低温有助于防止脑细胞降解。

使用研杵匀浆斑马鱼脑组织。匀浆可破坏细胞外基质，并启动神经元、巨噬细胞和小胶质细胞从脑组织中的分离。

此步骤还可将富含脂质的绝缘层——髓鞘——从神经元中分离出来。

将匀浆液通过筛网过滤，以截留较大的细胞团块。

离心滤液以沉淀细胞和髓鞘碎片。弃去含有碎片的上清液。

将沉淀重悬于适当的密度梯度介质中，并在其上覆盖缓冲液。

以低速离心试管。较轻的髓鞘碎片在缓冲液与密度梯度介质的界面处形成一条明显的条带，而较重的细胞则沉降至管底。

吸去上层液体，用新鲜培养基重悬脑细胞，以供后续使用。

向50个幼虫的培养基中加入1.5毫升15毫摩尔的Tricaine（每50毫升培养基），以制备麻醉液。然后，使用3毫升巴斯德吸管，每次转移10个幼虫至盛有冰冷E3培养基（含Tricaine）的55毫米培养皿中，进行终末麻醉。

在体视显微镜下，将10条幼虫排列于培养皿中央。然后使用手术剪在卵黄囊上方横切幼虫头部。

用一支3毫升的巴斯德移液管吸取所有头部组织，并尽量减少液体量，将其转移至冰上预冷的玻璃匀浆器中，匀浆器内含1毫升冰浴的A型培养基。

每隔 30 分钟更换一次含有冰冷 E3 加三卡因的微型培养皿，以确保切断操作在冰冷的 E3 加三卡因培养基中进行。

当颜色开始变淡时，更换玻璃匀浆器中的冰冻介质A。待所有头部样本收集完毕后，将玻璃匀浆器中的全部介质A移除，并加入1毫升新鲜的冰冻介质A。

保持匀浆器处于冰上，使用贴合紧密的研杵对脑组织进行破碎：对于3至5天的幼鱼，进行30到50次碾压和旋转；对于7天和8天的幼鱼，则进行50次。

然后，向细胞悬液中加入 2 毫升培养基 A，以稀释细胞并减少细胞与髓鞘的聚集。将细胞悬液通过 40 微米细胞筛网过滤至预冷的 50 毫升 Falcon 管中（置于冰上），以去除细胞团块。重复此步骤三次。

将1毫升细胞悬液分装至预冷的1.5毫升离心管中，在300 ×g、4 °C条件下离心10分钟。然后，使用带有23G × 1" 针头的10毫升注射器吸除上清液。

加入1毫升预冷的22%密度梯度介质，轻柔地覆盖0.5毫升预冷的1×DPBS，轻轻重悬细胞沉淀。在4°C条件下，以950×g离心30分钟，离心过程中不设刹车且采用慢加速。

离心后，弃去 DPBS 密度梯度培养基以及在界面处聚集的髓鞘。然后，用 0.5 毫升含 2% NGS 的 Media A 洗涤细胞，并在 4 摄氏度下以 300 × g 离心 10 分钟。

尽可能吸除上清液，然后将相同实验条件下收集的细胞沉淀合并于 1 毫升含 2% NGS 的培养基 A 中。

如果目标细胞表达荧光蛋白，将细胞悬液通过35微米带滤网帽的细胞筛，并转移至预冷的5毫升FACS管中，置于冰上避光保存。