从外周血单个核细胞（PBMNCs）生成诱导性神经干细胞（iNSCs）：一种基于仙台病毒的将PBMNCs重编程为iNSCs的操作流程

为了将体细胞重编程为诱导性神经干细胞（iNSCs）——即具有高自我更新能力和分化潜能的干细胞，首先需在无血清培养基中培养外周血单个核细胞，以扩增成红细胞系前体细胞。 

接着，将成红细胞悬液移入培养板中。用重组仙台病毒（SeV）处理细胞。这些病毒编码重编程转录因子。离心以沉淀细胞，并进行孵育。

副流感病毒（SeV）与宿主细胞膜融合后，病毒基因组在细胞质中进行转录，随后进行翻译。转录因子的异位表达可启动细胞重编程过程，且不将基因整合到宿主基因组中。 

现在，离心培养物以去除病毒。将转导后的细胞重悬于适当的培养基中，随后进行接种。接着，再次离心以去除细胞碎片。将细胞重悬于iNSC培养基中。

随后，将细胞接种于包被有蛋白质的培养板中。细胞会附着在培养板的蛋白包被层上。每隔一天用iNSC培养基补充已贴壁的细胞。培养一周后，每天更换为新鲜的iNSC培养基。 

培养基中的生长因子和化学成分可维持部分转导细胞的自我更新能力，并支持其多能性，从而将这些细胞完全重编程为诱导性神经干细胞（iNSCs）。随着时间推移，细胞开始形成iNSC克隆。选择理想的克隆进行培养。 

在第0天，收集MNC培养基中的细胞，转移至15毫升锥形管中。以200 × g 离心5分钟，吸除上清液，加入1毫升预热的MNC培养基重悬细胞。用台盼蓝计数活细胞，随后用预热的MNC培养基将细胞重悬至每孔200,000个细胞的浓度，接种于24孔板中。

将从零下80摄氏度保存条件下取出的含有仙台病毒的管子在37摄氏度水浴中解冻5至10秒，随后在室温下继续解冻。解冻完成后，立即置于冰上。按照感染复数为10的比例，将解冻后的仙台病毒加入含有单个核细胞（MNCs）的24孔板孔中。为促进细胞附着，将培养板在1,000 ×g 条件下离心30分钟，随后将培养板放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。

第1天，将细胞连同培养基转移至15毫升离心管中。为充分脱离残留细胞，用每孔1毫升MNC培养基冲洗孔板，并将冲洗液连同细胞一起加入离心管中。将该细胞悬液在200 × g 条件下离心5分钟，吸除上清液，用500微升新鲜预热的MNC培养基重悬细胞，然后接种至24孔板的一个孔中。

第2天，使用已稀释的聚-D-赖氨酸（50微克/微升）和D-PBS，每孔1毫升，对6孔板进行包被，室温孵育至少2小时。吸除6孔板中的聚-D-赖氨酸溶液，将板子置于垂直洁净台中干燥约10分钟。随后，向6孔板每孔加入1毫升已稀释的层粘连蛋白（5微克/毫升），37摄氏度孵育4至6小时以完成包被。使用前用D-PBS洗涤孔板。

第3天，将所有经仙台病毒转导的单个核细胞（MNCs）接种至已包被多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白的6孔板中，使用诱导性神经干细胞（iNSC）培养基。在第5天和第7天，向6孔板的每孔中轻轻加入1毫升预热至37摄氏度的iNSC培养基。

从第9天到第28天，每天更换新鲜的预热iNSC培养基。观察iNSC克隆的出现情况，约2至3周后，使用烧制过的玻璃移液管挑选形态合适的克隆。随后，将每个克隆转移至6孔板中的单独孔内进行扩增。