MSC 播种支架制备:一种制备间充质干细胞播种支架用于手术植入小鼠模型的技术

癌细胞产生趋化归巢因子，将间充质干细胞或间充质干细胞或间充质干细胞从血管吸引到肿瘤位置。

要研究这些细胞对体外肿瘤生长的影响，首先取灭菌的支架基质。将其转移到含有所需培养基的孔板中，以预润湿支架。将其放在干燥的表面上，以去除粘附在支架上的多余培养基，以获得更好的细胞粘附力。将部分干燥的脚手架转移到新的井中。将一滴 MSC 悬浮液播种到支架上。

此外，在孔的角落添加更多培养基以创建一个水合室，以防止在后续孵育过程中从液滴中蒸发培养基。孵育以使间充质干细胞粘附在支架表面。翻转脚手架以露出未播种的表面。在这一侧移液一滴新的间充质干细胞悬浮液，让间充质干细胞粘附。

MSC 粘附在支架的两侧后，用更多培养基覆盖它，确保所有细胞都与培养基接触。孵育直至间充质干细胞生长并渗入支架的间隙和孔隙内。MSC 接种支架已准备好进行手术植入。

小鼠前48小时准备支架，首先将PLA支架切割成大约2 x 2毫米的切除腔大小的碎片。通过浸入 70% 乙醇中 15 分钟对支架进行消毒。15分钟后，将支架浸入PBS中。然后，将支架放入含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基中，同时准备用于接种的细胞。

为了制备细胞，首先，使用 0.05% 胰蛋白酶提升培养的 MSC。在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。孵育后，确保细胞已提升。然后，将DMEM添加到烧瓶中以灭活胰蛋白酶。接下来，将烧瓶内容物转移到 15 毫升离心管中。使用血细胞计数器计数细胞。然后，通过以 100 x g 离心 5 分钟，将每个支架的 10 次 5 次沉淀到第五个 MSC。

离心后，吸出上清液并将间充质干细胞重悬于每5乘以10至第五个细胞的5微升DMEM中。然后，用镊子从 DMEM 浸泡中取出支架，并将其放在 6 孔板的盖子上。将支架从盖子上提起，留下一滴多余的 DMEM。将脚手架放回盖子上，放在新的干燥位置。重复三到五次。然后，将部分干燥的支架放入新的 6 孔板中进行播种。

部分干燥的支架可提供最佳的细胞接种结果。如果支架太湿，细胞会从支架上滑落并粘附在下面的板上。如果支架干燥，液滴不会扩散到整个支架上，导致初始细胞分布不良。

使用移液器，轻轻混合间充质干细胞管以均质化悬浮液，因为一些细胞可能已经沉降到底部。将 2.5 微升新鲜混合的 MSC 悬浮液直接缓慢移液到支架上，在支架顶部产生一个小液滴。向每个孔的边缘添加 300 微升 DMEM，以防止细胞液滴快速蒸发。在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，让细胞附着在支架上。

孵育后，使用镊子轻轻翻转孔板中的支架。接种 2.5 微升新鲜混合的 MSC 悬浮液，以总共获得 5 次 10 到每个支架接种的第五个细胞。孵育30分钟以使细胞附着在支架上后，通过向6孔板的每个孔中加入2毫升来用DMEM覆盖支架。轻轻提起支架，让介质在支架下方流动。植入手术前在这种状态下在37摄氏度下孵育48小时。