胶质瘤细胞的荧光标记：一种基于慢病毒载体转染的方法以获得表达荧光蛋白的胶质瘤细胞用于深层组织成像

体内脑癌成像技术包括将荧光标记的癌细胞注射到小鼠脑内，以观察肿瘤的发育过程。进行荧光标记时，将胶质瘤细胞与慢病毒颗粒共同孵育。该慢病毒载体携带编码红外荧光蛋白 iRFP 的基因。

病毒结合到胶质瘤细胞表面，并将RNA释放入细胞内。细胞内的酶将病毒RNA转化为双链DNA，后者整合到细胞基因组中，从而实现iRFP的表达。iRFP的激发和发射峰值位于近红外区域，在该区域组织的吸收和散射最小，因此可实现精确的深层组织成像。

接下来，移除用过的培养基并加入胰蛋白酶。胰蛋白酶是一种蛋白酶，可消化细胞黏附蛋白，使细胞从培养瓶表面脱落。反复吹打以分离单个细胞。将细胞悬液收集至离心管中并进行离心。然后加入适量缓冲液重新悬浮沉淀。

将细胞悬液分装至流式细胞术管中，并使用荧光染料 DAPI 对细胞进行染色。DAPI 可将死细胞的细胞核染成亮蓝色，从而将其与活细胞区分开来。利用荧光激活细胞分选仪（FACS）根据荧光信号，从其他细胞群体中分选出活的 iRFP 阳性细胞。分离得到的细胞可用于注射到小鼠体内，进行肿瘤成像。

首先，在10厘米培养皿中加入5毫升培养基，接种1×10⁶个胶质母细胞瘤细胞，于细胞培养箱中孵育24小时。次日清晨，用慢病毒转导细胞，该慢病毒表达目的荧光蛋白，感染复数（MOI）为5，随后将细胞放回培养箱继续孵育。

24 小时后，将上清液更换为 5 毫升新鲜培养基，继续培养 48 小时。培养结束后，在 37 摄氏度条件下加入 3 至 5 毫升胰蛋白酶消化 10 至 15 分钟，随后轻轻吹打，使脱落的细胞完全解离。

通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于500 µL分选溶液中。将细胞分装至适当数量的FACS管中，并使用DAPI共染以排除死细胞。然后将FACS管上机至流式细胞仪，根据荧光表达情况将活细胞分选至含有新鲜分选溶液的15 mL锥形管中。

离心后，将构建体阳性/DAPI阴性细胞重悬于5毫升培养基中，接种至新的10厘米培养皿，在37°C培养48至72小时。培养结束后，将细胞分种至多个培养皿中，用于后续的体内实验。