JoVE 实验百科全书
癌症研究
0 次观看 • 4:15 分钟 • July 8th, 2025
脑肿瘤干细胞（BTSCs）是脑肿瘤细胞的一个亚群，能够启动肿瘤生长和转移，因此成为癌症治疗的潜在理想靶点。为了在体外研究药物对BTSC迁移的影响，首先需在合适的培养基中制备均匀的BTSC悬浮液。将其中一份悬浮液用目标药物进行处理。
同时，取一个多孔趋化迁移小室，其包含可将每个孔分隔为上室和下室的膜性插件。将所需的细胞外基质蛋白移液至下室及膜性插件上，孵育以促进蛋白的聚合。
向底层小室中加入含有目标趋化因子的适宜基础培养基，并将膜性插入物置于其上。接着，将药物处理与未处理的BTSC悬液接种至膜性插入物中。使用活细胞显微镜对培养板进行长时间成像观察。
在培养过程中，脑肿瘤干细胞（BTSCs）会黏附于小室插入物的蛋白质基质上。在上下室之间形成的趋化因子浓度梯度作用下，未经处理的BTSCs会通过膜插入物的孔隙，穿过蛋白质基质，迁移至下室。
然而，药物处理对细胞的功能活性产生负面影响，降低了BTSC的迁移能力。现在，使用适当的软件分析并定量下室中迁移的BTSC。未经药物处理的BTSC表现出更强的迁移能力，而经药物处理的BTSC则迁移减少。
为了评估某种感兴趣的药物处理对细胞迁移的影响，首先，用适当浓度的药物在合适的实验时间内对细胞进行预处理。准备趋化作用板时，每种条件需在96孔趋化作用板中分别对三个膜插件孔和三个底部储液孔进行包被：膜插件孔加入75微升、底部储液孔加入225微升浓度为0.2毫克/毫升的I型胶原蛋白溶液，在37摄氏度下孵育1小时。
孵育结束后，从每个孔中吸去胶原溶液，注意不要刮伤胶原涂层，并用无菌 PBS 洗涤孔板两次。最后一次洗涤后，将插入物从板中取出，并向趋化板的每个底部储液孔中加入 225 µL 含 10% FBS 的无生长因子培养基。
然后，将上层插入物以倾斜角度轻轻放回下层储液槽中，以避免产生气泡，并在每个插入物孔中加入含 2.5 × 10³ 个解离的 BTSCs 的 50 µL 无生长因子培养基。在接种前，必须将 BTSCs 完全解离为单细胞，并仔细计数，以避免上层插入物中出现细胞团块或细胞过多。
为了对BTSC沿FBS梯度的迁移进行成像，将培养板放入活细胞成像系统中，并设置自动成像软件每1至2小时获取一次培养板的显微图像，持续最长72小时。图像采集完成后，选择新的处理定义，以区分膜底侧BTSC与其插入孔，必要时修改分析参数，确保细胞与背景膜之间能够被准确区分。
为了定量分析穿过孔隙的细胞，需针对每种条件下的三个重复孔，采集膜底侧细胞的表面积数据。然后，以随时间变化的迁移细胞面积（单位：平方微米）来绘制细胞迁移图。