脑肿瘤干细胞（BTSC）神经球侵袭实验：一种用于分析药物处理对神经球来源BTSC侵袭影响的体外实验方法

脑肿瘤干细胞（BTSCs）是脑肿瘤内的一类细胞亚群，具有自我更新能力，并促进肿瘤进展和治疗耐药性。为确定药物对BTSC体外侵袭的影响，首先在培养瓶中使用适当的培养基制备BTSC悬液，并对其中一份悬液加入待研究的药物进行处理。

将培养瓶进行孵育。培养基成分可促进细胞增殖。细胞保持悬浮状态，从而形成称为神经球的球形细胞簇。当神经球达到所需大小后，收集神经球。让其通过重力沉降，并移除培养基。随后，将未经处理和经药物处理的神经球重悬于含有合适细胞外基质蛋白和药物的预冷培养基中。

将悬浮液接种至预冷的多孔板中。让神经球沉降至孔底，以利于成像。接着孵育以促进基质蛋白聚合，使神经球包埋于其中。使用活细胞显微镜对神经球进行长时间成像。在培养过程中，包埋的脑肿瘤干细胞（BTSCs）会分泌蛋白水解酶，降解基质蛋白，从而促进细胞迁移。

随着时间推移，基质降解程度增加，为神经球中的脑肿瘤干细胞（BTSC）向周围基质侵袭创造了适宜的微环境。使用适当的软件，测量不同时间点神经球的总面积。未经药物处理的BTSC表现出更大的表面积，表明其侵袭率高于经药物处理的BTSC。

为评估BTSC神经球的侵袭能力，首先在神经球侵袭铺板前，将待测化合物以预定浓度加入培养瓶中，并孵育预定的时间。当神经球的平均直径达到约150至200微米时，轻柔倾斜并用移液器吹打混匀培养瓶，然后将重悬的BTSC神经球溶液每500微升转移至冰上预置的1.5毫升离心管中，每种实验条件对应一管。

尽可能吸出每个1.5毫升离心管底部的培养基，注意不要丢失神经球沉淀，然后在500微升新鲜配制的0.4毫克/毫升I型胶原溶液中轻柔重悬神经球。将胶原悬浮液中的神经球每100微升转移至冰上新的96孔板中每个条件下的三个孔内，并静置5分钟使神经球沉降。

必须将神经球置于冰上静置5分钟，这一点至关重要。否则，神经球将无法处于同一焦平面上，影响成像效果。在细胞培养孵育箱中孵育5分钟使胶原蛋白聚合后，将培养板转移至活细胞成像系统的载物台，以获取铺板时神经球大小的参考图像，此时侵袭尚未开始。随后，设置软件每1至2小时采集一次图像，直至侵袭速率趋于平稳，通常在24小时左右达到平台期。

为了观察BTSCs随时间推移侵袭基质过程中表面积的增加情况，使用10倍物镜对每组三个重复孔中的每个孔采集四幅图像。为确定以孔内汇合百分比表示的相对细胞表面积，建立一个图像处理定义，专门突出显示细胞与孔背景的差异。随后，收集每个时间点各孔的总细胞表面积数据。计算三个重复孔的平均值，并通过绘制细胞面积随时间的增加曲线来分析BTSCs的侵袭能力。