从牛脑毛细血管中分离和培养原代脑周细胞：一种无内皮细胞污染的周细胞分离与培养方案 关键词：周细胞，原代培养，脑毛细血管，内皮细胞污染，牛脑，细胞分离

在中枢神经系统中，周细胞是一类多功能细胞，包裹着形成毛细血管内层细胞衬里的内皮细胞。周细胞有助于调节血流并维持大脑稳态。

为了分离周细胞，首先取含有冷冻牛脑毛细血管的冻存管。解冻后，将内容物转移至含有所需培养基的离心管中。离心以沉淀毛细血管。弃去含有冻存液的上清液。用培养基重悬毛细血管沉淀物，并将悬液接种到包被有细胞外基质蛋白的培养瓶中。

孵育以使毛细血管贴附于培养瓶中的包被层。更换为含肝素的培养基。在培养过程中，细胞外基质蛋白包被可促进周细胞从毛细血管片段迁移并增殖，而肝素则可刺激内皮细胞迁移。

用含有肝素的培养基替换用过的培养基。随着时间推移，周细胞会伸出细长的突起，并牢固地贴附在培养瓶上。在底物空间有限的情况下，内皮细胞增殖并形成接触抑制的单层细胞。当周细胞达到适当密度时，移除培养基，并用缓冲液清洗培养瓶。

使用胰蛋白酶-EDTA 从培养瓶中消化并分离松散贴壁的内皮细胞。随后加入培养基以中和胰蛋白酶-EDTA 的活性。反复用培养基洗涤，以去除已脱落的内皮细胞。加入新鲜培养基，并确保周细胞仍贴附在培养瓶上。将富含周细胞的培养物置于培养箱中孵育，使其增殖。

首先，在37摄氏度水浴中解冻一管毛细血管。毛细血管完全解冻后，将其转移至离心管中，加入30毫升DMEM-完全培养基，于500 × g 离心5分钟。随后弃去上清液，将沉淀物重悬于10毫升新鲜DMEM-完全培养基中。将细胞悬液转移至已包被的T75培养瓶中，在37摄氏度、含10%二氧化碳的培养箱中孵育4至6小时，使毛细血管贴壁。孵育结束后，在光学显微镜下观察培养瓶中的细胞状态。

毛细血管片段现在应已贴附在培养瓶底部。在接种毛细血管后的第4天，在显微镜下观察以确认其融合度约为60%至70%。吸除培养基，用PBS轻轻洗涤细胞。加入2毫升解冻的胰蛋白酶-EDTA溶液，将培养瓶放入培养箱中孵育1至3分钟，期间频繁取出培养瓶并在显微镜下观察细胞脱落情况。当内皮细胞开始变圆时，轻轻敲击培养瓶以促进细胞脱落。

当细胞脱落后，加入10毫升DMEM-完全培养基以终止胰蛋白酶消化。用培养基冲洗培养瓶数次，吸出内皮细胞悬液，该悬液现在可用于其他用途。向培养瓶中加入10毫升DMEM-完全培养基，置于光学显微镜下观察，确认周细胞仍存在并贴壁。随后将培养瓶放回培养箱中，使富含周细胞的培养物继续生长。