从人脑组织中分离脑毛细血管：一种优化的人脑毛细血管提取方法

脑毛细血管是血脑屏障的重要组成部分——这是一种半透性屏障，可选择性地允许溶质在血液与脑组织之间移动。为分离脑毛细血管，需从新鲜的人脑组织开始，去除软脑膜并切除白质。

将脑组织切碎成更小的片段。将碎片转移至含有适当缓冲液的匀浆器中并进行匀浆。匀浆可使组织解离，释放毛细血管和组织碎片进入溶液。

将匀浆转移至新的离心管中，并加入适量的合适密度梯度介质。离心溶液以沉淀毛细血管。密度梯度介质过多或过少均会导致毛细血管得率降低。弃去上清液。

将沉淀重悬于牛血清白蛋白（BSA）或添加BSA的缓冲液中。BSA可稳定消化酶并维持毛细血管的结构完整性。接着，使用适当的滤器过滤溶液，以去除大血管和组织碎片。

然后，将滤液通过孔径更小的滤膜。该滤膜可截留脑部毛细血管，同时允许较小的碎片和红细胞通过。随后，将滤膜翻转，用含BSA的缓冲液冲洗，将毛细血管洗入新的离心管中。

离心溶液并弃去上清液。将纯化的毛细血管重悬于缓冲液中，保存以供后续使用。

开始此操作时，记录人脑组织的重量，应约为10克。在显微镜下，用镊子小心去除所有脑膜，并使用手术刀切除白质。然后，仔细切碎脑组织，并用手术刀剪切约5分钟。

将脑组织转移至组织研磨器中，并加入30毫升分离缓冲液。随后，以50 rpm的速度对每个样品进行100次研磨。避免在空气中搅拌，以防止产生气泡。每研磨25次记录一次时间，并记录完成100次研磨所需的总时间。之后，将匀浆液转移至冰上的Dounce匀浆器中。将悬浮液匀浆约20次，并避免产生气泡。

然后，将脑匀浆均匀分配到四个 50 毫升离心管中，并记录匀浆的总体积。务必加入正确体积的 Ficoll。Ficoll 体积过少或过多均会导致密度不准确，从而无法有效分离毛细血管与细胞碎片，进而减少毛细血管沉淀并降低得率。

用 10 毫升裂解缓冲液冲洗研杵和匀浆器，并将液体分配至四个离心管中。接下来，将 50 毫升密度梯度缓冲液分配到离心管中。用盖子 tightly 封闭离心管。随后，通过剧烈振荡试管，混合匀浆液、密度梯度介质和缓冲液。在 4 摄氏度下以 5,800 ×g 离心 15 分钟。然后，弃去上清液，并将每个沉淀重悬于 2 毫升 1% BSA 中。

重悬沉淀后，将悬液通过300微米孔径的滤网过滤。毛细血管会通过滤网，而较大的血管和较大的脑组织碎片则留在滤网上。用最多50毫升的1% BSA小心冲洗滤网，然后弃去滤网。为了将毛细血管与红细胞及其他脑组织碎片分离，将毛细血管滤液分装至530微米细胞滤筛上。

毛细血管被此滤膜截留，而红细胞、其他单个细胞以及小块脑组织碎片则通过滤膜并被收集于滤液中。接下来，用25毫升1% BSA溶液洗涤每张滤膜。将所有滤液倒入第六张滤膜上，以提高回收率。用50毫升1% BSA溶液洗涤每张滤膜。保留含有毛细血管的细胞滤膜，弃去滤液。然后，将滤膜翻转，用50毫升1% BSA溶液将毛细血管冲洗至50毫升离心管中。

用移液器枪头轻轻施加压力，并在滤膜上移动以冲洗脑毛细血管。确保将所有脑毛细血管冲洗下来，尤其是滤膜边缘部分。避免产生气泡，因为气泡会使过滤过程更加困难，并增加毛细血管丢失的风险。收集毛细血管后，将所有样品在4摄氏度下以1,500 × g 离心3分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬于约3毫升的分离缓冲液中。

然后，将同一份样本的所有重悬沉淀合并至一个15毫升的锥形管中，并用分离缓冲液充满。在4摄氏度下以1,500 ×g离心3分钟，再洗涤两次。使用显微镜在100倍放大倍数下结合相机记录毛细血管纯度。分离得到的脑毛细血管现在可用于实验，或进行后续处理，或进行速冻，并在-80摄氏度下置于冻存管中保存至少6至12个月。