荧光肽类底物酶谱法：一种利用荧光底物在酶谱凝胶中检测蛋白酶活性的改良技术

Zymography 是一种电泳技术，通过将蛋白质底物与聚丙烯酰胺凝胶共聚，用于检测水解酶及其活性。首先，将样品溶解于含有甘油、十二烷基硫酸钠（SDS）和溴酚蓝的 zymography 缓冲液中。

甘油使上样缓冲液的密度高于凝胶的电泳缓冲液，从而便于将样品加载至凝胶孔中。SDS（一种阴离子去垢剂）可使样品中的蛋白质变性，并使其表面携带负电荷。溴酚蓝（一种示踪染料）有助于监测样品在凝胶中的迁移进程。

将含有荧光底物的聚丙烯酰胺凝胶中加入样品，以检测蛋白酶活性。现在连接电极并开始电泳。所产生的电场会使所有结合了SDS的酶向正极迁移穿过凝胶。

电泳完成后，取出凝胶并用含有非离子型去污剂的变性缓冲液洗涤，以置换SDS，从而允许酶复性。接着，将凝胶置于含有二价阳离子的显色缓冲液中孵育，以激活凝胶中的酶。

活性蛋白酶会切割荧光底物，导致荧光增强。通过成像凝胶可观察到荧光蛋白条带，其荧光强度与蛋白酶活性成正比。

首先，将样品溶解于常规的zymography样品缓冲液中。向凝胶装置中加入400毫升1x Tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液。每孔最多上样35微升样品。在4摄氏度条件下以120伏电压电泳1.5小时，或直至分子量标准指示目标蛋白酶已进入肽段分离胶层。随后，从塑料夹板中取出凝胶。

在室温下，用变性缓冲液轻轻振荡洗涤凝胶三次，每次洗涤持续10分钟。将凝胶转移至显色缓冲液中孵育15分钟。随后，更换为新鲜的显色缓冲液，在37摄氏度下轻轻振荡孵育24小时。之后，使用配备适当激发和发射滤光片的荧光凝胶扫描仪/成像仪对凝胶进行成像。