基于子宫内电穿孔的基因递送技术：向小鼠胚胎小脑细胞注射质粒DNA的方法

首先取一只仰卧位的妊娠麻醉雌性小鼠模型。去除腹部区域的毛发以准备小鼠。切开皮肤及下方的肌肉层，暴露子宫角——即容纳可存活胚胎的部位。

现在，将子宫角从腹腔中拉出。取一支尖端锋利的玻璃毛细管，内含所需质粒DNA溶液。找到胚胎的脑部，通过子宫壁将质粒DNA溶液注入第四脑室。该位置位于小脑原基前方，是DNA递送的理想靶区。

注射后，撤出空的毛细管。接下来，对已注射DNA的胚胎进行电穿孔时，将两个电极置于子宫壁上方，使正极覆盖小脑原基，负极覆盖耳部周围区域。

根据所需时长施加电脉冲。这些脉冲可使小脑神经元细胞膜通透性增加，从而使质粒DNA进入靶细胞。最后，将子宫角放回腹腔内的自然位置。缝合切口，将小鼠转移至笼中，并让其恢复。

首先将一根硼硅酸盐玻璃毛细管装入微电极拉制仪中，拉制形成细小的尖端。用黑色墨水在毛细管尖端做标记，以便在注射过程中更清晰地观察，并在玻璃上绘制刻度。在体视显微镜下操作，使用直尺和锋利的针状镊子将尖端修剪至约6毫米长度，并形成一个锋利的单面斜面边缘。

将1%快绿母液通过0.22微米滤膜过滤，以去除溶液中的染料颗粒。将单导向RNA质粒与荧光素酶报告质粒等体积混合，使每种质粒的终浓度至少为1微克/毫升。

将血浆溶液用快绿染色至终浓度为0.05%。使用异氟烷麻醉怀孕的CD-1小鼠后，将小鼠仰卧位置于加热垫上，并给予镇痛剂。涂抹眼膏以防止手术期间眼睛干燥。用胶带固定四肢，并用消毒剂对腹部进行消毒。

用纱布覆盖小鼠，仅暴露手术区域。在皮肤上做一个长约2厘米的切口后，找到腹白线，并使用钝头组织剪在腹膜上做一个稍小的第二道切口。用预热的无菌 PBS 润湿打开的腹腔。

接下来，使用环形镊子小心地将子宫角从腹腔中取出。在两个相邻胚胎的卵黄囊之间的间隙处夹住子宫壁，轻轻牵拉。牵拉过程中避免对胚胎施加任何压力。子宫角取出后，用预先准备好的玻璃毛细管吸取约10至15微升的有色质粒溶液。此过程中应避免产生任何气泡。

用环形镊子轻轻夹住胚胎，定位颈部区域。将玻璃毛细管的尖端缓慢刺入后脑背侧，进入第四脑室。注入约 1 µL 质粒混合物。确认染色的 DNA 未从脑部泄漏，并可见呈菱形结构。

在此过程中，最重要的是用质粒溶液完全填充第四脑室的整个区域，以将DNA递送至小脑原基的远端部分。同时，务必确保操作过程中不引起任何出血。

将带有直径为5毫米电极板的铂金镊子横向置于胚胎头部，负极覆盖耳部，正极置于子宫壁上方的小脑原基处，并施加电方波脉冲。

当所有胚胎完成电穿孔后，小心地将子宫角放回腹腔，并用无菌 PBS 填充。让子宫角自然滑入原位。关闭麻醉装置，将动物腹部朝下放入新的笼子中以恢复。