斑马鱼胚胎中肿瘤细胞的长期原位移植：一种将肿瘤细胞高效递送至斑马鱼胚胎第四脑室以长期分析肿瘤细胞行为的方法

在原位移植过程中，将来自荷瘤供体的肿瘤细胞或组织移植到同种受体的相应组织中。首先，将从荷瘤斑马鱼中分离的荧光标记脑肿瘤细胞在适当的缓冲液中制备成均一的细胞悬液。使用细尖的凝胶上样吸头，将该细胞悬液吸入显微注射针中。

接下来，将装有样品的针头固定到显微操作仪的针夹中。随后，将麻醉后的斑马鱼胚胎转移至预制的注射板中。为便于显微注射操作，应将胚胎侧向放置，以观察脑室——即大脑内充满脑脊液的腔隙网络。

调整针尖位置，将肿瘤细胞悬液注射到胚胎后脑的第四脑室，即呈菱形的腔室。肿瘤细胞占据脑室内空腔。撤出针头。将胚胎转移至含有生理盐水的培养皿中。在荧光体视显微镜下观察胚胎，确认脑室腔内存在肿瘤细胞。

孵育胚胎。注射后数小时内，肿瘤细胞迁移并侵入周围脑组织，并在其中增殖，形成新的肿瘤。随着时间推移，肿瘤细胞持续增殖并进一步侵袭，扩散至全脑。

使用移液管将10至20个麻醉后的胚胎转移至注射板的边缘区域。胚胎应侧向放置，使脑室清晰可见且易于操作。根据需要使用角度探针调整胚胎位置，并将其置于远离注射板外缘的位置。

然后，使用加样枪头将 1 至 2 微升的肿瘤细胞悬液加入注射针中，并将针插入操纵器。接着，手动降低操纵器，使针头保持 45 度角。调节显微操作仪在 x、y 和 z 方向的旋钮，直至针头位于胚胎头部上方略高处，且在其右侧约 5 毫米的位置。

使用体视显微镜，缓慢调节显微操作仪的 X 方向，直至针头刺入胚胎的第四脑室。注意不要让针头刺入心脏或卵黄。为了确保注射的一致性，必须对胚胎进行麻醉处理。肿瘤组织必须充分解离成单细胞悬液，且针头需刺入第四脑室，但不可进一步深入至心脏。

踩下显微注射仪的脚踏开关，注入肿瘤细胞悬液。注射完成后，用新鲜的卵水轻轻冲洗已注射的胚胎，使其从注射板上脱落并进入培养皿中。随后，在暗室中使用荧光体视显微镜检查已注射的胚胎。确认注射压力、角度、针头大小以及细胞悬液的黏度使得肿瘤细胞占据脑室空间的25%至50%。

将胚胎重新放回28摄氏度培养箱中过夜。次日，通过观察形态学和生理学特征（如正常的心脏和脑部发育）来评估胚胎存活情况，方法如前所述。