微肿瘤的生成：一种用于培养三维微肿瘤以分析药物处理反应的体外培养技术

微肿瘤——即三维体外肿瘤细胞聚集体——能够高度模拟体内肿瘤微环境，是评估药物疗效的有前景平台。制备微肿瘤时，首先需获得来源于患者的肿瘤细胞的均匀悬液。

接下来，用所需体积的预冷人源细胞外基质（ECM）稀释细胞悬液。将少量细胞-基质混合液移至含有疏水涂层针头的定制金属板上。针头上的疏水涂层可使液滴保持球形形态。

孵育以促进细胞外基质（ECM）凝胶化，使细胞包埋其中。随后将包埋有细胞的凝胶微珠转移至含有适量培养基的大体积培养板中。根据实验需求孵育相应时间。在培养过程中，  封装的细胞开始在细胞外基质（ECM）中聚集，该基质为细胞的非刺激性生长提供了环境。

此外，培养基成分会扩散通过基质，促进细胞增殖，从而使其在微珠内形成三维微肿瘤。随后，将含有微肿瘤的微珠转移至含培养基的多孔板中。对其中一组微肿瘤施加目标药物并进行孵育。

每两周用培养基和药物溶液对微肿瘤进行补充。通过活细胞成像检测微肿瘤中的细胞形态。未经处理的微肿瘤表现出持续生长，而药物敏感的微肿瘤则呈现生长抑制。

为生成微肿瘤，将解离后的患者来源胶质母细胞瘤异种移植细胞系离心，然后将沉淀重悬于每2微升胎牛血清（FBS）含50,000个细胞的溶液中。接着，将细胞以1:4的细胞与生物胶比例加入预冷的高密度人源生物胶中进行稀释。随后，使用电子多通道移液器将每种细胞混合物各10微升分配至具有疏水涂层的96针钢制板的每个针位上。

在混合细胞、培养基和生物凝胶时，必须避免产生气泡，同时仍需快速高效地操作，以便在人源生物凝胶开始于针头上凝固之前完成微肿瘤的制备。

当所有肿瘤接种完毕后，将3D肿瘤转移至组织培养孵育箱中孵育20分钟，使肿瘤微球凝胶化。孵育结束后，将微肿瘤转移至含有完全神经基础培养基的10厘米培养皿中，并放回孵育箱继续培养。

培养1至2天后，使用宽口移液管将微肿瘤转移至96孔培养板的各孔中，每孔含有50 µL神经基础培养基，并向每孔加入50 µL相应的给药溶液。将处理后的微肿瘤置于组织培养孵育箱中培养1至14天，每周两次更换新鲜培养基和药物溶液。