分离小鼠脑血管:从小鼠脑样本中分离完整血管的方案

脑血管被一层紧密连接的内皮细胞包围。这些细胞周围有一层基底膜以及周细胞和星形胶质细胞等细胞成分。

要将脑血管与周围的神经元和神经胶质细胞隔离开来，请取一个装有小鼠大脑浸没在均质缓冲液中的烧杯。将其切成小块。将脑组织均质化以使其解离，释放神经元、神经胶质细胞和脑血管。这种治疗还会破坏神经元周围的髓鞘。

匀浆转移到管中并离心以将血管造粒。较轻的成分，如神经元和神经胶质细胞，留在上清液中，而髓磷脂在沉淀周围形成致密的界面层。

弃去上清液，并将带有附着髓磷脂层的血管沉淀重悬于合适的密度梯度培养基中。离心以沉淀血管并获得漂浮在上清液顶部的富含脂肪的髓磷脂带。将髓鞘带与用过的培养基一起取出，并将沉淀重悬于新鲜缓冲液中。

使用过滤器组件过滤粗制备品，该过滤器组件包含足够小的过滤器，以至于容器无法通过它。将过滤器转移到含有缓冲溶液的新鲜烧杯中。轻轻刮擦滤纸以分离容器并存放以供进一步分析。

用手术刀从小鼠颈部到鼻子切开皮肤，然后将皮肤向后拉。用PBS清洗头骨以去除任何污染的毛发，然后将一把剪刀插入嗅球前面的头骨中。打开剪刀将头骨分成两部分破裂，并用抹刀取出大脑。

接下来，从侧脑室解剖脉络丛，并将大脑转移到装有 20 毫升冰上 B1 溶液的 150 毫升烧杯中。然后，使用两把手术刀将大脑用力切成 2 毫米的组织碎片，并使用自动 Dounce 均质机在冰上以 400 rpm 的速度将组织均质化 20 次。

要纯化容器，请将匀浆转移到 50 毫升塑料管中，并在摆动转子离心机中旋转组织浆液。在血管沉淀的顶部会形成一个主要由髓磷脂组成的大白色界面。弃去上清液。

加入 20 毫升冰冷的 B2 溶液，用力摇晃试管 1 分钟。第二次离心后，髓磷脂将在上清液表面形成一层致密的白色层。缓慢旋转管子，让 B2 溶液在倒出时沿着壁流过，并丢弃髓鞘和上清液。

然后，使用用吸水纸包裹的塑料移液器去除管壁上的任何残留液体，注意不要接触容器颗粒，然后将管子倒置在冰上。接下来，将沉淀重悬于 1 毫升冰冷的 B3 溶液中，然后再加入 5 毫升 B3 溶液，注意血管不会形成聚集体。

现在，将一个 20 微米尼龙网过滤器放在贝克尔烧瓶顶部，并用 10 毫升冰冷的 B3 溶液平衡过滤器。将容器制剂倒在过滤器上，并用另外 40 毫升冰冷的 B3 溶液小心地冲洗容器。

然后，使用干净的镊子立即将过滤器转移到装有 30 毫升新鲜 B3 溶液的烧杯中，并轻轻摇晃将容器从过滤器上连接起来。将烧杯内容物倒入 50 毫升塑料管中。然后，离心后，将沉淀重悬于 1 毫升冰冷的 B3 溶液中。