离体电穿孔法转染鸡胚小脑切片：一种通过导入编码绿色荧光蛋白的质粒DNA以可视化颗粒细胞发育的方法

小脑颗粒细胞是大脑中最丰富的神经元类型。外颗粒层（EGL）仅由颗粒细胞前体（GCPs）组成，这些前体细胞会分化并向内迁移，形成内颗粒层（IGL）。

为了观察颗粒细胞的发育过程，首先通过将阳极连接到培养皿底部来制备电穿孔室。加入培养基以覆盖电极。接着，将培养插件放置在覆盖有培养基的电极上。然后，将鸡胚小脑切片以矢状方向转移至培养插件上。

矢状面可使目标外颗粒层（EGL）相对于小脑的不同层次被识别。在外颗粒层上添加含有GFP质粒DNA的黏性染料溶液。该GFP质粒DNA编码一种绿色荧光蛋白，可在细胞质内均匀分布，从而实现活细胞成像。

接下来，将阴极置于靠近 EGL 的培养基中，但不要直接接触组织。然后，对 EGL 的不同区域施加多个电脉冲。电脉冲会在细胞膜上诱导产生瞬时孔隙，使细胞能够摄取质粒 DNA。随后，质粒 DNA 使颗粒细胞表达 GFP。

在荧光显微镜下对小脑切片进行成像，以观察颗粒细胞在不同发育阶段的分化及迁移模式。

使用绝缘胶带将电穿孔仪的阳极固定在60毫米培养皿底部，以构建电穿孔腔室。加入约1毫升HBSS以覆盖电极。接着，将一个0.4微米的培养插入物放置在被HBSS覆盖的电极上方。

使用尖端剪断的3毫升巴斯德吸管，将已识别的脑片转移至培养插件上，每个插件最多放置5片。随后将脑片彼此分开，并使其以矢状方向沉降到培养插件上。用移液器吸除脑片上多余的培养基。将插件放置在电极上，使其与电极充分接触。

在此装置中，含有脑片的培养插件将置于培养基表面，以维持电路连接，同时允许对阴极进行空间定位。使用P10移液枪头，将5微升用20%快绿稀释的DNA溶液滴加至每片脑片的目标区域表面。添加快绿可确保DNA溶液具有足够黏稠度，防止DNA广泛扩散。

然后，将阴极置于目标组织上方，对样品进行电穿孔。放置阴极时应尽可能靠近组织但避免直接接触组织。根据需要，在每一片小脑切片的外颗粒层多个区域重复进行电穿孔。

实验完成后，将培养插件转移至一个30毫米的培养皿中。向每个培养样本中，在培养插件下方加入1毫升预热的培养基。确保插件不会漂浮在培养基上。培养插件应与培养基接触，但组织切片不应浸没在培养基中。