0 次观看 • 5:43 分钟 • July 8th, 2025
开始电穿孔操作：取一支含有目标质粒溶液的玻璃移液管，将其连接至装有银丝电极的微移液管固定器上，并确保电极插入移液管内。取一个电穿孔 chamber，其中包含浸没在人工脑脊液中的超薄海马脑片。
将接地电极浸入电穿孔室内的液体中，以进行后续电穿孔操作。将移液管尖端放入电穿孔室中，并记录基线电阻。使用显微镜将移液管尖端定位至目标细胞附近。当移液管与神经元膜接触时，其电阻会急剧上升。
施加正向气压，使神经元膜产生微小凹陷。快速施加轻微负压，推动膜向上移动，从而在移液管尖端与膜之间形成松散封接。重复此过程数次，以对膜进行预处理，避免细胞破裂。
在制备后，施加强负压以与膜形成高阻封接（吉欧姆封接）。利用电脉冲在膜的封接区域形成瞬时孔道。这些孔道有助于质粒进入目标神经元内部。电穿孔完成后，孔道重新闭合，将质粒封闭在神经元内。
为准备用于电穿孔的脑片培养物，将感兴趣的培养插件转移至含有900微升培养基的3厘米培养皿中，并将培养物置于台式二氧化碳培养箱内。接着，用每插件1毫升的脑片培养基在3.5厘米培养皿中预孵育新鲜的培养插件至少30分钟，并用10%次氯酸钠溶液对电穿孔装置的管路灭菌5分钟。
灌流结束后，用离子化高压灭菌水冲洗管路至少30分钟，然后灌注含有0.001毫摩尔河豚毒素的滤膜除菌人工脑脊液。将电穿孔仪的脉冲参数设置为：振幅负5伏、方波脉冲、持续时间为500毫秒的脉冲串、频率50赫兹、脉宽500微秒。用玻璃移液管吸取5微升含质粒的内液，轻轻甩动并多次轻敲管尖，以去除任何滞留的气泡。
使用解剖显微镜确认尖端无损伤，并将移液器尖端牢固地安装到电极上。当尖端接触 aCSF 时，记录电穿孔仪显示的移液器电阻读数。为分离切片培养物，用锋利的刀片切割培养插件膜，并使用尖头镊子小心地将切片培养物转移至电穿孔室中。然后，用切片固定锚固定培养物的位置。
对于目标细胞的电穿孔操作，用嘴向移液管施加正压，并使用三维旋钮控制装置将移液管尖端移动至切片培养物表面附近。在显微镜下观察培养物，将移液管尖端靠近目标细胞，持续施加正压，直至细胞表面形成凹陷。一旦观察到凹陷，立即用嘴轻轻施加负压，使移液管尖端与细胞质膜之间形成松散封接。
膜会略微进入移液管内。应观察到移液管初始电阻大约增加至2.5倍，这可通过扬声器发出的音调升高来判断。迅速重新施加正压，使凹面重新形成。随后立即重复至少两次上述压力循环操作，中间不要停顿。在最后一次施加压力脉冲后，持续施加负压1秒，此时扬声器发出的音调达到稳定的最高音。使用脚踏开关快速触发电穿孔仪。
电穿孔后，轻轻将移液管从细胞回撤约100微米，期间不施加压力，然后重新施加正压，确认电阻与接近下一个细胞前的基线读数相近。当所有目标细胞完成电穿孔后，将脑片培养物转移至预先准备好的新鲜培养插件中，并将插件置于35摄氏度环境下培养，最长可培养3天。