向分离的小鼠胚胎注射微泡：一种将微泡造影剂递送至活体小鼠胚胎血管系统的技术

进行微泡递送时，首先将含有气态核心的内皮细胞靶向脂质外壳微泡均匀悬浮液装入与导管相连的注射器中。

将该组装体装入注射泵，并将玻璃针连接到管路上。接着，将一只表达特定内皮细胞受体的冷藏小鼠胚胎转移至置于体视显微镜载物台上的培养皿中。

轻柔地将胚胎从卵黄囊和羊膜中移出。固定卵黄囊和胎盘边缘。用预热的缓冲液冲洗胚胎，以恢复其血液流动。在胚胎表面覆盖预热的超声耦合剂，以实现最佳的超声波传导。补充缓冲液以维持其生理状态。

使用注射泵，以所需的流速将微泡悬浮液小心地注入胎盘盘片羊膜表面合适的静脉中。注入的微泡随血液循环流动，并与血管内皮细胞表面的特异性受体结合。

使用超声换能器将高频超声波传递至胚胎。微泡内高度可压缩的气体核心使其发生非线性振荡，散射出与入射波频率不同的超声波。这些信号以及组织的线性信号会返回至换能器。

换能器将信号传递给成像系统，该系统可区分微泡散射信号与组织信号，从而生成胚胎血管的增强超声图像。

用移液器吸取所需体积的微泡储备液，加入生理盐水等分试样中。用移液器尖端轻轻搅拌混合。然后，使用21号针头将稀释后的微泡溶液吸入一支洁净的注射器中。取下针头后，排除注射器中的任何气泡，并连接鲁尔接头和管路。缓慢推动溶液至管路末端，确保不产生气泡。

最后，将注射器插入注射泵，设置流速为每分钟20 µL，总体积为20 µL，以输注微泡。将拉制的玻璃针连接至管路末端。将泵移至注射台附近。使用带孔勺子从冷藏的培养皿中随机选取并取出一个胚胎。将胚胎置于解剖皿中，放置于体视显微镜下超声成像台的注射台上。

接下来，找到血管分布最少的胚胎一侧。此处为血管分布稀疏的区域，通常位于头部附近。然后使用精细镊子剪开或撕开少量卵黄囊和羊膜，以便能够取出胚胎，但切勿过度。接着，轻柔地将囊膜从胚胎周围移开。随后，将胚胎侧放，使胎盘和脐血管位于前方。

使用少量橡皮泥固定解剖皿。用四枚昆虫针将卵黄囊和胎盘边缘固定，注意避开主要血管。使用装有预热至45摄氏度PBS的注射器冲洗胚胎，直至观察到血液流入胚胎。脐动脉可通过搏动性、鲜红色的血液辨认。脐静脉及其相关血管网络中的血液颜色较暗，且通常在胎盘侧覆盖于脐动脉血管之上。

此时，调整培养皿的位置，以便于进行注射操作。胚胎复苏后，用预热的超声耦合剂覆盖胚胎（注意不要覆盖胎盘）。使用精细镊子小心去除胚胎周围的气泡，并用预热的 PBS 补充培养皿中的液体。在整个操作过程中，注意观察 PBS 和耦合剂注射器中的液体余量，并根据需要将备用注射器添加至加热烧杯中。

接下来，将玻璃针固定在解剖皿边缘的一大团橡皮泥上，并将针尖插入 PBS 中。在胎盘盘的绒毛膜表面选择一条距离主支尽可能远的静脉。然后，使用剪刀将针尖修剪至与血管大小相匹配，以轻微倾斜的角度剪切针尖。使用弹簧剪刀的边缘去除玻璃上的任何毛刺。

现在，使用注射泵以每分钟 20 微升的速度将微泡溶液缓慢注入玻璃针头，直至针尖处的所有空气被完全排出，且可观察到微泡自由流入 PBS 溶液中。停止泵注并将其重置为注射体积 20 微升。注意避免空气进入注射针头，以防将空气注入胚胎的血管系统。

将玻璃针头轻轻插入胎盘中选定的静脉，并确保其固定不动。移开体视显微镜镜筒，调整超声探头位置，使胚胎位于6毫米和10毫米焦点之间且居中。随后开始成像，并启动微泡的团注注射。一分钟后，当注射完成后，启动计时器以开始数据采集步骤。