基于拭子的结膜共生细菌分离技术：一种从小鼠模型结膜中分离共生细菌的方法

眼结膜含有共生细菌。这种固有微生物群通过激活免疫细胞来攻击进入眼表的有害微生物，从而保护眼睛免受感染。

为了分离共生细菌，将一只麻醉小鼠置于侧卧位。取一支浸有适宜培养基的无菌眼拭子，将湿润的拭子尖端插入左眼的内侧结膜区域。轻压眼球，并来回移动拭子以沿结膜采集多样化的共生菌群。

取出拭子并将其搅拌到含有微生物富集培养基的试管中。此步骤可将截留在拭子棉网中的细菌释放到培养基中。弃去拭子，并将试管进行孵育，以促进细菌生长的开始。

将接种了眼拭子的增菌培养基滴加数滴至血琼脂平板上，按所需模式涂布，然后进行培养。培养基中的酪蛋白和大豆蛋白胨可提供肽类合成所需的氮源，而氯化钠则维持渗透压平衡。

共生细菌具有可分解血液培养基中血红蛋白的溶血素酶。这会在琼脂平板上产生特征性图案，使不同细菌增殖形成形态各异的菌落。通过计数菌落数量，可确定其在中国结膜中的相对丰度。

通过轻捏小鼠后肢足垫确认其已充分麻醉。若无任何运动反应，方可继续操作。指定一只手用于处理麻醉后的小鼠，另一只手用于操作眼拭子及培养物。将小鼠从笼中取出，置于工作台面上，使其侧卧，暴露左眼。用异丙醇喷洒戴着手套的双手，并用纸巾擦干。

用专用的培养基操作手取下标记好的BHI微量离心管的管盖，并将该管放回架子上。将棉拭子头部浸入BHI培养基中，然后在取出拭子的同时，将拭子头在管内壁旋转两次，以去除多余液体，随后完全取出拭子。

用抓握小鼠的手轻轻抓住小鼠颈部的皮肤。另一只手将眼拭子的尖端置于左眼的内侧结膜区域。轻压眼球，并在下眼睑与眼球之间以擦窗方式来回移动拭子10次，保持恒定压力。在不接触毛发的情况下，将拭子尖端垂直于插入方向轻轻取出。将拭子带棉部分朝下直接放入含有BHI培养基的已标记微量离心管中。

向擦拭过的眼睛滴加一滴眼药。如有需要，可采集皮肤或毛发拭子作为对照样本，每次采样之间需适当对手套进行消毒。操作完成后，将小鼠放回笼中。将拭子置于冰上静置10至15分钟。然后，对戴着手套的双手进行消毒，取出拭子，并将拭子尖端在培养基中混匀10次。通过将拭子尖端在试管内壁旋转5次的方式取出拭子，并将其丢弃至生物危害容器中。对每只小鼠重复上述操作。

将试管在37摄氏度下静置孵育1小时以富集样本。孵育期间，为每只小鼠眼拭子或对照拭子在室温下标记一个TSA平板，并将其分为两半。从孵箱中取出富集后的样本，置于冰上。短暂涡旋振荡样本以混匀。然后，取10 µL样本加至TSA平板上，倾斜平板形成条带。重复此操作两次。

在培养皿分界线的另一侧，用每个10微升的样品创建10个点。将培养皿置于洁净的培养箱中，于37°C分别孵育18小时、2天和4天，防止琼脂平板干燥。计数条带中的菌落。记录菌落形态，并计算形态相似菌株每拭子的菌落形成单位（CFU）。