小鼠瓣膜间质细胞的分离：一种从鼠主动脉瓣分离和培养VIC的酶消化法

心脏主动脉瓣是一种三叶状结构，由分布于致密细胞外基质中的内层瓣膜间质细胞（VICs）以及覆盖其表面的瓣膜内皮细胞（VECs）组成。

为了分离心内膜下间质细胞（VICs），首先将一只安乐死的小鼠仰卧位固定。通过腹部和胸部正中切口暴露心脏，在左心房与心室之间做一个小切口，随后用生理盐水灌注以排出血液。在主动脉弓水平切断升主动脉，并取出心脏。

横切并弃去心室远端的三分之二部分，然后沿纵轴解剖剩余的心脏组织，以暴露呈“U”形的主动脉瓣瓣叶。切除瓣叶，并用预冷缓冲液冲洗以去除血液。

随后，用低浓度的胶原酶溶液处理小叶并进行孵育。在低浓度下，胶原酶（一种蛋白水解酶）仅部分降解细胞外基质，从而使小叶表面的血管内皮细胞脱离。

离心后弃去含有酶的上清液，并用缓冲液替代，将重悬的沉淀转移至培养皿中。收集小叶组织，用高浓度的胶原酶溶液进行第二次消化。孵育后，胶原酶进一步降解细胞外基质，使瓣膜间质细胞（VICs）释放到溶液中。

离心以沉淀VICs，并重悬于适当的培养基中。最后，将少量细胞悬液接种至多孔板中，以促进VICs贴附于孔底。孵育以使VICs增殖。

实验开始前，使用70%乙醇清洁并消毒所有手术器械和操作区域，并将手术器械高压灭菌30分钟。初始准备工作完成后，使用乙醇清洁一只8周龄已安乐死小鼠的胸部和腹部区域。

使用剪刀打开小鼠的腹部和胸部。然后用小型手术剪在左心房与左心室之间进行剪切。通过灌注10毫升冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清除心脏中的血液，并保留3毫米长的升主动脉后切除心脏。在体视显微镜下，将心脏在心室中部水平横向剪开，并从左心室向主动脉方向剪开，分离主动脉瓣膜。随后仔细解剖主动脉瓣。将所有瓣膜收集至一个小型35毫米组织培养皿中。

在75毫升的细胞培养皿中，用5毫升新配制的含抗生素的冷10毫摩尔HEPES缓冲液洗涤分离的瓣膜，然后在5毫升I型胶原酶中于37摄氏度孵育30分钟，期间持续震荡。孵育结束后，以150 × g 离心5分钟，弃上清，将沉淀用2毫升毫摩尔HEPES缓冲液重悬，高速涡旋振荡30秒，洗涤一次。

将离心管中的悬浮液收集到35毫米的培养皿中，使用细镊子小心地将组织碎片转移至新的离心管中。随后，在15毫升离心管中加入5毫升I型胶原酶，于37摄氏度下持续振荡消化35分钟。用1毫升移液器重悬细胞以分离细胞，于4摄氏度下以150 ×g 离心5分钟。用2毫升完全DMEM重悬分离后的细胞沉淀，于4摄氏度下以150 ×g 离心5分钟，重复此清洗步骤两次。

接种时，将沉淀重悬于1毫升完全培养基中，并将其加入6孔细胞培养板的一个孔内，加入的培养基量需最少。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中静置培养。孵育3天后，在显微镜下观察细胞，确认靠近组织碎片处有细胞生长。当可见细胞数量达到1,000个时，用经高压灭菌的镊子小心移除组织碎片，并更换培养基。