0 次观看 • 4:17 分钟 • July 8th, 2025
色素上皮细胞是终末分化的立方状细胞，通过紧密连接相互连接。排列在虹膜上的这些上皮细胞称为虹膜色素上皮细胞或IPE细胞，而位于视网膜附近的则称为视网膜色素上皮细胞或RPE细胞。
为了提取这些细胞，取一个完整的新西兰兔眼球。用消毒剂处理眼球，以清除其表面的任何微生物。用缓冲液冲洗掉消毒剂。在虹膜附近做一切口。利用此切口，沿虹膜边界进行完整的环形切割，将眼球分为包含虹膜的前段和包含视网膜及玻璃体的后段。
取眼前段并移除晶状体以暴露虹膜。摘除虹膜并将其置于培养皿中。随后取眼后段，去除眼球中的凝胶状玻璃体和视网膜。
用胰蛋白酶处理虹膜和眼球，并进行孵育。胰蛋白酶可降解紧密连接和细胞外基质蛋白，从而启动上皮细胞的解离。弃去胰蛋白酶，加入适量的培养基。轻轻刮擦虹膜和眼球表面，使上皮细胞释放到培养基中。
最后，将IPE和RPE细胞分别接种到不同的孔中。细胞即可用于后续的下游实验。
处死动物后，使用弯头剪刀和蜂鸟镊摘除眼球，然后清除眼球上残留的肌肉组织和皮肤。将眼球收集到装有非无菌 PBS 的 50 毫升离心管中，并将离心管转移至超净工作台。用碘溶液浸泡消毒 2 分钟，随后将眼球转移至装有无菌 PBS 的 50 毫升离心管中。
将一只眼球置于无菌纱布上，牢固握住视神经附近的部位，然后用#11手术刀在虹膜边缘附近剪切。使用剪刀沿虹膜周围剪开，移除眼前段，并将其放入培养皿中，保留含有玻璃体的眼球部分，直至分离出视网膜色素上皮（RPE）细胞。
为了分离虹膜色素上皮（IPE）细胞，使用精细镊子移除晶状体，并轻柔地取出含有 IPE 细胞的虹膜。将虹膜置于培养皿中，用无菌 PBS 清洗。加入 500 微升 0.25% 胰蛋白酶，于 37 摄氏度孵育 10 分钟。吸除胰蛋白酶，加入 500 微升完全培养基，用经火焰抛光的平头巴斯德吸管轻柔刮取 IPE 细胞。
收集细胞悬液，置于1.5毫升离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并在24孔板中每孔接种20万个细胞，每孔加入1毫升完全培养基。将培养板放入培养箱中，在37°C、5%二氧化碳条件下培养。
为了分离视网膜色素上皮（RPE）细胞，使用细镊子从眼球后段去除玻璃体和视网膜。将眼球置于24孔板中，每只眼球加入500 µL 0.25%胰蛋白酶，于37°C孵育10分钟。吸除胰蛋白酶，每只眼球加入500 µL完全培养基，用弯曲的火焰抛光巴斯德吸管轻轻刮取RPE细胞。
收集细胞悬液，放入1.5毫升离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并按照先前所述方法接种细胞。将培养板置于培养箱中。