分离 IPE 和 RPE 细胞:一种从兔眼获得眼色素上皮细胞的技术

色素上皮细胞是通过紧密连接连接的终末分化的长方细胞。虹膜内衬的这些上皮细胞是虹膜色素上皮细胞或 IPE 细胞，靠近视网膜的上皮细胞是视网膜色素上皮细胞或 RPE 细胞。

要提取这些细胞，请取一只完整的兔眼。用消毒剂处理眼睛，去除眼睛表面的任何微生物。用缓冲溶液洗掉消毒剂。在虹膜附近做一个切口。使用这个开口，沿虹膜边界做一个完整的圆形切口，将眼睛分为包含虹膜的前段和包含视网膜和玻璃体液的后部。

取前节并丢弃晶状体以进入虹膜。取出虹膜并将其放在培养皿上。随后，取后节并丢弃眼球上的凝胶状玻璃体液和视网膜。

用胰蛋白酶处理虹膜和眼球并孵育。胰蛋白酶降解紧密连接和细胞外基质蛋白，启动上皮细胞的解离。丢弃胰蛋白酶并添加合适的培养基。轻轻刮擦虹膜和眼球表面，以释放培养基中的上皮细胞。

最后，将IPE和RPE细胞接种在单独的孔中。细胞已准备好进行进一步的下游测定。

动物实施安乐死后，使用弯曲的剪刀和 Colibri 镊子对眼睛进行摘核，然后清洁眼睛上剩余的肌肉组织和皮肤。将眼睛收集在装有非无菌PBS的50毫升管中，并将管转移到层流罩中。将它们浸入碘溶液中两分钟进行消毒，然后将眼睛转移到装有无菌PBS的50毫升管中。

将一只眼睛放在无菌纱布敷布上，将眼睛牢牢地靠近视神经，然后用 #11 手术刀在虹膜边缘附近切开。用剪刀剪开虹膜周围，去除前节，并将其放入培养皿中，将球茎与玻璃体一起留出，直到分离出视网膜色素上皮细胞或RPE细胞。

要分离虹膜色素上皮细胞或 IPE 细胞，请用细镊子取出晶状体，然后轻轻地拉出含有 IPE 细胞的虹膜。将虹膜放入培养皿中，并用无菌PBS清洗。加入 500 微升 0.25% 胰蛋白酶，并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。取出胰蛋白酶，加入500微升完全培养基，并用扁平的火抛光巴斯德移液器轻轻刮擦IPE。

收集细胞悬液，并将其放入 1.5 毫升管中。使用 Neubauer 室计数细胞，并在含有 1 毫升完全培养基的 24 孔板中每孔接种 020 万个细胞。将板放入培养箱中，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养。

要分离 RPE 细胞，请用细镊子从后段去除玻璃体液和视网膜。将球茎放入24孔板中，每只眼睛加入500微升0.25%胰蛋白酶，并在37摄氏度下孵育10分钟。除去胰蛋白酶，每个球体加入 500 微升完全培养基，并用弯曲的火抛光巴斯德移液器轻轻刮擦 RPE 细胞。

收集细胞悬液，并将其放入 1.5 毫升管中。使用Neubauer室计数细胞，并如前所述接种细胞。将板放入培养箱中。