猪离体角膜细菌性角膜炎模型:一种在角膜上皮细胞中建立细菌感染的技术

在脊椎动物眼中，角膜--最外层的保护层--被铜绿假单胞菌感染，导致角膜炎症--角膜炎。

要建立离体角膜角膜炎模型，请将猪眼角膜巩膜纽扣放入培养皿中。该组织部分由被巩膜残余物包围的角膜组成 - 纤维眼覆盖物。用含抗生素的培养基补充培养皿，以消除角膜上皮表面的污染微生物。

找到角膜的中央部分。以所需的图案进行浅表水平和垂直切口，刺穿最外层的角膜上皮层。将切开的组织（角膜面朝下）转移到专门的空心模具中。

液化琼脂填充角膜腔并使其凝固，将组织限制在模具内。倒置模具以暴露角膜上皮的受伤表面。将假单胞菌悬浮液移入角膜的切口区域。在模具上覆盖更多的生长培养基，以实现最佳细菌生长。用培养基补充培养皿并孵育。

细菌穿过上皮切口侵入基质。在基质内部，细菌会导致免疫细胞、蛋白质和角膜中的液体浸润，从而导致炎症反应。积液会增加角膜混浊，证实细菌性角膜炎。

培养皿中取出培养基，并用一毫升无菌PBS冲洗角膜两次。用镊子握住角膜并轻轻挤压。使用 10A 手术刀在角巩膜纽扣的中央部分通过上皮层到达下面的基质进行四个切口 - 两个垂直，两个水平。

无菌玻璃模具放入六孔板中，宽部分朝上。然后，将角膜放在玻璃模具的中间，上皮面朝下，角膜的受伤部分以玻璃模具为中心。

加入一毫升琼脂溶液，将玻璃模具完全填充。让琼脂凝固后，倒置玻璃模具，使角膜上皮朝上。

玻璃模具必须用琼脂密封至边缘，以防止接种物或药物溶液泄漏。

将 200 微升细菌培养物直接移液到切割区域。此外，对于每个实验，通过向一个角膜添加 200 微升无菌 PBS，而不是添加细菌培养物来建立对照。

接下来，在每个角膜的顶部添加 185 微升 PBS，以保持上皮湿润。然后，在每个孔的底部加入一毫升不含抗生素的DMEM。将六孔板在 37 摄氏度、湿度和 5% 二氧化碳下孵育长达 24 小时。

六孔板中丢弃DMEM，并向每个孔中加入一毫升无菌PBS以冲洗。轻轻取出PBS，不要触摸角膜巩膜按钮的中央部分。使用无菌镊子取出玻璃模具，并将其放入 5% Distel 中。用一毫升PBS轻轻冲洗角膜巩膜按钮的顶部两次。

使用细尖镊子提起角膜巩膜纽扣的边缘，将其从下面的琼脂上分离，然后将其转移到装有一到两毫升冰冷PBS的50毫升管中。为了帮助将细菌从角膜上皮和切割区域分离，将PBS添加到管中，并使用细头均质器剪切受感染角膜的顶部。组织不必完全液化。

涡旋以重悬沉降的细菌，并将 20 微升均质角膜添加到 180 微升 PBS 中。然后，在 96 孔板中对匀浆进行连续稀释。

将 10 微升稀释的匀浆移液到血琼脂平板上。

板孵育16小时后，计算菌落形成单位的数量。