猪角膜离体细菌性角膜炎模型：一种在角膜上皮细胞中建立细菌感染的技术

在脊椎动物的眼睛中，角膜——最外层的保护性覆盖物——会受到铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染，从而导致角膜炎症性疾病——角膜炎。 

为建立离体角膜炎模型，将猪眼角膜巩膜片置于培养皿中。该组织片段由角膜及其周围残留的巩膜——即纤维性眼球外层覆盖物——组成。向培养皿中加入含抗生素的培养基，以清除角膜上皮表面的污染微生物。

定位角膜的中央区域。在预定模式下进行浅表的横向和纵向切口，穿透最外层的角膜上皮层。将切开的组织以角膜面朝下的方式转移至特制的中空模具中。 

将液化的琼脂注入角膜腔内，使其凝固，从而将组织固定在模具中。翻转模具，暴露角膜上皮的损伤面。将铜绿假单胞菌悬液滴加至角膜的切口区域。在模具上覆盖更多培养基以促进细菌最佳生长。向培养皿中补充培养基后进行孵育。 

细菌穿过上皮切口侵入基质层。在基质层内，细菌引发免疫细胞、蛋白质和液体在角膜中浸润，导致炎症反应。液体积聚使角膜混浊度增加，证实为细菌性角膜炎。

移除培养皿中的培养基，用一毫升无菌 PBS 缓冲液冲洗角膜两次。用镊子夹住角膜并轻轻挤压。使用 10A 手术刀在角膜巩膜瓣的中央区域进行四道切口——两道垂直，两道水平——切穿上皮层至下方的基质层。

将无菌的玻璃模具放入六孔板中，宽口朝上。然后将角膜置于玻璃模具中央，上皮面朝下，角膜的损伤部位居中放置于玻璃模具内。

加入一毫升琼脂溶液，将玻璃模具完全填满。待琼脂凝固后，将玻璃模具倒置，使角膜上皮朝上。

必须用琼脂将玻璃模具密封至边缘，以防止接种物或药物溶液泄漏。

用移液器将200微升细菌培养物直接加入切割区域。此外，每次实验均需设置对照，即向一只角膜中加入200微升无菌PBS，代替细菌培养物。

接下来，在每个角膜的顶部加入 185 µL 的 PBS，以保持上皮湿润。然后，在每个孔的底部加入 1 mL 不含抗生素的 DMEM。将六孔板置于 37°C、含湿度和 5% CO₂ 的环境中孵育，最长孵育 24 小时。

弃去六孔板中的DMEM，每孔加入1毫升无菌PBS洗涤。轻轻移除PBS，避免接触角巩膜瓣的中央区域。使用无菌镊子取出玻璃模具，并将其放入5% Distel中。用1毫升PBS轻轻冲洗角巩膜瓣顶部两次。

使用尖头镊子抬起角巩膜纽扣片的边缘，将其从下方的琼脂上分离，并转移至含有 1 至 2 毫升冰上预冷 PBS 的 50 毫升离心管中。为帮助从角膜上皮及切口区域脱离细菌，向管中加入 PBS，并使用尖头匀浆器剪切感染角膜的表面组织。组织无需完全液化。

涡旋振荡以重悬沉淀的细菌，将20 µL匀浆后的角膜组织加入180 µL PBS中。随后，在96孔板中对匀浆液进行系列稀释。

用移液器将10微升稀释后的匀浆液滴加到血琼脂平板上。

孵育培养板16小时后，计数菌落形成单位的数量。